摘要
为探究中华绒螯蟹Kcna基因的结构、表达模式及生长发育中的分子功能,克隆了中华绒螯蟹Kcna(命名为Es-Kcna)基因的全长,并开展了生物信息学分析和时空表达模式研究;观察了干扰Kcna基因后中华绒螯蟹生长表型性状的变化;筛选了Es-Kcna基因的SNP标记并与种群地理分布、生长性状进行了关联分析。结果显示:Kcna基因位于中华绒螯蟹第46号染色体上,全长945 304 bp,含有9个外显子;其中,cDNA全长2 080 bp,开放阅读框1 584 bp,编码527个氨基酸;原子总量为8 433,分子结构式为C2719H4210N702O787S15,预测蛋白等电点(pI)为5.23,相对分子量为59.81 Ku。系统进化树分析显示Es-Kcna基因与三疣梭子蟹Kcna基因的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示Es-Kcna基因在蜕壳前期、蜕壳间期和蜕壳后期的肌肉、心脏、肠道等6种组织中均有表达,其中以肌肉组织中的表达丰度最高。与对照组相比,干扰Kcna基因的表达后,实验组蟹的体质量、蜕壳增重率和第二步足长度显著降低;肌肉组织切片结果显示实验组步足肌肉肌纤维直径小于对照组。此外,在Es-Kcna基因的第8外显子上鉴定出1个SNP位点(A1 461G),该位点在辽河野生群体显著富集GG基因型,而在长江野生群体富集AA基因型。生长性状的关联分析表明,具有AA型个体的步足长度显著长于GG型个体。本研究为Kcna基因调控中华绒螯蟹生长的分子功能和遗传育种研究提供了研究基础,并为区分长江、辽河野生中华绒螯蟹提供重要参考。
电压门控钾离子通道蛋白(Voltage-gated potassium channel protein shaker, Kcna)是一类跨膜糖蛋白,结构高度保守,由α亚基组成的同源四聚体构成,广泛存在于原核生物及真核生物细胞膜上,是钾离子通道家族中的重要成员之
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),又名河蟹,是我国重要的名贵水产品,是我国很多地区水产养殖的特色产
本实验中筛选Kcna基因SNP分子标记的2龄实验蟹来自于上海海洋大学水产动物种质资源研究室前期(2005—2017年)收集的长江、辽河水系野生群体以及养殖群体,开展Kcna基因分子功能的1龄实验蟹为在实验室条件下饲养的“江海21”品种。选取生长健康、规格一致(2~3 g)的扣蟹放在循环水养殖系统中饲养,水温(26±1) ℃,每天喂食两次并及时清理残饵与粪便。取蜕壳后2 d(蜕壳后期)、蜕壳后15 d(蜕壳间期)和新颚足刚毛形
在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中下载预测的中华绒螯蟹Kcna(XM_050831530.1)基因序
引物Primers | 序列(5'-3')Sequences | 用途Usage |
---|---|---|
K-5race-RT | TGGCACGTTGACTGGTCTTC | 5race |
K-5race-1R | CCGGTTGCGATCGAAGAAGT | |
K-5race-2R | TCCGGAAACTGATTCAACGT | |
K-3race-1F | TCGGCTCACTGTGTGCCATC | 3race |
K-3race-2F | CAGACCAGGAGGAGATGCAG | |
K-ORF-F | GGCCTCGCTTGGGATTACAC |
ORF克隆 cloning of ORF |
K-ORF-R | TGAATCCTTCCTGCCACACAA | |
K-qpcr-F | GCCGGAGAACGAATTCCAAA | qPCR |
K-qpcr-R | TGATGGCAACCACTCTAGCA | |
S27-F | GGTCGATGACAATGGCAAGA | |
S27-R | CCACAGTACTGGCGGTCAAA | |
K-ds-F | TACGTTGGCGACTGTGGTAG |
RNA干扰 RNA interference |
K-ds-R | GCGGGTTGCAATTCTGCTTT | |
G-ds-F | CAGTGCTTCAGCCGCTACCC | |
G-ds-R | AGTTCACCTTGATGCCGTTCTT | |
K-T7-ds-F | taatacgactcactatagggTACGTTGGCGACTGTGGTAG | |
K-T7-ds-R | taatacgactcactatagggGCGGGTTGCAATTCTGCTTT | |
G-T7-ds-F | taatacgactcactatagggCAGTGCTTCAGCCGCTACCC | |
G-T7-ds-R | taatacgactcactatagggAGTTCACCTTGATGCCGTTCTT | |
K-SNP-F | ACCATCTCTATACCCTGTCCCTT |
SNP筛选 SNP screening |
K-SNP-R | TCAGACGTCAGTTTCGATGCTCAT |
利用DNAMAN软件进行测序序列的拼接和人工校准。分别利用ORFfinder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测Kcna基因的开放阅读框,Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质理化性质,TMHMM 2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白跨膜结构域,SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)预测蛋白质结构和功能。为构建Kcna基因的系统进化树,分别从NCBI数据库上下载三疣梭子蟹、克氏原螯虾、斑节对虾、凡纳滨对虾、中国明对虾(Penaeus chinensis)、日本对虾(Penaeus japonicus)、红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)和果蝇的Kcna基因的氨基酸序列,利用Clustal W软件进行氨基酸多序列比对,然后用MEGA 11.0软件中的最大似然法构建系统发育进化树。
将不同蜕壳时期的肌肉、心脏、肝胰腺、眼柄、鳃和肠道的总RNA逆转录成cDNA。逆转录体系:5× gDNA digester Mix 3 μL,Total RNA 1 μg,RNase-free H2O 补充至 15 μL;反应程序:42 ℃孵育2 min,向反应液中加入4× Hifair Ⅲ SuperMix plus 5 μL,25、55、85 ℃分别反应5、15、5 min。qPCR引物及内参基因见
使用RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems试剂盒(Promega,美国)合成Kcna和GFP基因的dsRNA序列。实验初始时,挑选规格一致的实验蟹共36只,每只蟹记录初始体质量(W1)、壳长(L1)和第二步足长度(F1,下文简称步足长度),随机分为实验组和对照组,每组18只;分别从左侧第二步足基部注射等量的Kcna基因的dsRNA(3 μg/g)(实验组)和不含有Kcna基因序列的绿色荧光蛋白GFP基因的dsRNA(对照组)。两组均每3天注射1次,直到下一次蜕壳完成。RNA干扰过程中,每天检查记录蜕壳和死亡情况。在下一次蜕壳后第4天,记录终末体质量(W2)、壳长(L2)和步足长度(F2),记录每只蟹的蜕壳间隔天数(M),并计算蜕壳增重率(WGR)和特定生长率(SGR),公式如下:
WGR(%)=100×(W2-W1)/W1 | (1) |
SGR(%/d)=100×(lnW2-lnW1)/M | (2) |
式中:W1和W2分别为初始和终末时各组扣蟹平均体质量;M为每只蟹的脱壳间隔天数。
干扰周期结束后,对实验蟹左侧第二步足肌肉取样,进行石蜡切片和H.E染色,并利用Image J软件进行肌纤维直径测量。具体测量方法是:在显微镜下随机选取5个视野,每个视野内任选10根肌纤维测量其长轴与短轴,计算出两者平均值,即为肌纤维直
基于测序验证获得的Kcna基因序列,结合已经发表的中华绒螯蟹基因
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图1 中华绒螯蟹Kcna基因结构和蛋白结构域预测
Fig.1 Gene structure and protein domain prediction of Kcna gene in E.sinensis
(a)Kcna基因结构;(b)Kcna预测蛋白结构域。
(a) Gene structure of Kcna; (b) Protein domain prediction of Kcna.
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图2 中华绒螯蟹与其他节肢动物Kcna基因系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of Kcna gene among E. sinensis and other arthropod species
荧光定量发现Kcna基因在中华绒螯蟹不同蜕壳时期的肌肉、肠道、眼柄、心脏、鳃和肝胰腺中均有表达。整体而言,在肌肉和心脏中的表达量相对较高,蜕壳间期和后期肌肉中表达量最高(图

图3 Kcna基因在中华绒螯蟹不同组织和不同蜕壳时期中的表达情况
Fig.3 Expression profiles of Kcna gene in different tissues and molting stages of E.sinensis
(a,b,c)Kcna基因在不同组织中的表达比较;(a)蜕壳间期,(b)蜕壳前期,(c)蜕壳后期;(d,e,f,g,h,i)Kcna基因在相关组织不同蜕壳时期的表达比较;(d)肌肉,(e)心脏,(f)肠道,(g)肝胰腺,(h)鳃,(i)眼柄。图中不同小写字母表示组间存在显著差异(P< 0.05)。
(a,b,c) the expression profiles of Kcna gene among different tissues,(a)inter-molting,(b)pre-molting,(c)post-molting.(d,e,f,g,h,i) the expression profiles of Kcna gene among different molting stages in relative tissues,(d)muscle,(e)heart,(f)intestine,(g)hepatopancreas,(h)gill,(i)eyestalk. Different lowercase letters indicate significant differences among groups (P< 0.05).
从不同蜕壳时期来看,Es-Kcna基因在肌肉、心脏、肠道和肝胰腺中的表达量均是蜕壳间期最高;在肌肉中,蜕壳间期的表达量显著高于前期和后期(P< 0.05),见
经过一个完整蜕壳周期的RNA干扰,发现对照组终末体质量(W2)、终末步足长度(F2)和蜕壳增重率(WGR)都显著高于实验组(P< 0.05);终末壳长(L2)、蜕壳周期(MI)和特定生长率(SGR)无显著变化(P> 0.05),见
生长指标Indicators of growth | 实验组Experimental group | 对照组Control group |
---|---|---|
初始体质量Initail body mass/g | 2.83±0.41 | 2.85±0.35 |
终末体质量Final body mass/g |
3.44±0.5 |
3.56±0.6 |
初始壳长Initail carapace length/mm | 16.28±0.69 | 16.63±0.72 |
终末壳长Final carapace length/mm | 18.11±0.45 | 18.29±0.41 |
初始步足长度Initial leg length/mm | 12.31±0.74 | 12.64±0.72 |
终末步足长度Final leg length/mm |
13.86±0.4 |
14.45±0.4 |
蜕壳周期Molting interval/d | 27.81±4.22 | 28.26±3.94 |
蜕壳增重率Weight gain rate after molting/% |
21.31±3.1 |
25.75±4.6 |
特定生长率Specific growth rate/(%/d) | 0.70±0.23 | 0.78±0.34 |
注: 表中不同小写字母表示组间存在显著差异(P< 0.05)。
Notes: Different lowercase letters in the table indicate significant differences between groups (P< 0.05).
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图版 RNA干扰后第二步足肌纤维直径变化
Plate Changes in muscle fiber diameter of the second walking leg after RNA interference
1.对照组; 2.实验组。
1.Control group; 2.Experimental group.
对256只来自于长江和辽河水系的野生样本和245只养殖样本进行Kcna基因的PCR产物测序,在Es-Kcna基因第8外显子上鉴定出一个SNP突变位点(A1 461G)。将该位点与野生样本的水系来源进行关联,结果发现长江水系中华绒螯蟹中Kcna基因的AA型的比例显著高于GG型,在2005年度时AA的比例达到了63.30%(
基因型 Genotypes | 1999年 | 2005年 | 2014年 | 2017年 | ||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|
长江 Yangtze river | 辽河 Liaohe river | 长江 Yangtze river | 辽河 Liaohe river | 长江 Yangtze river | 辽河 Liaohe river | 长江 Yangtze river | 辽河 Liaohe river | |
AA | ⁃ | 0% | 63.30% | ⁃ | 50% | 20.34% | 37.21% | 0% |
GG | ⁃ | 86.11% | 0.70% | ⁃ | 11.90% | 67.80% | 18.60% | 97.83% |
AG | ⁃ | 13.89% | 30.00% | ⁃ | 38.10% | 11.86% | 44.19% | 2.17% |
注: “⁃”代表未分析该年度的野生样本。
Notes: “⁃” means no wild individuals used for the year.
将该SNP分子标记位点(A1 461G)与体质量、壳长、步足长度进行关联分析。在具有表型数据的190只野生群体中,由于采集的野生个体规格差异较大,故体质量、壳长、步足长度本身存在一定的差异,为了减少误差,将步足长度矫正为比例性状,即步足长度/壳长,发现AA型平均步足长度比例为0.75,显著高于AG型的0.73和GG型的0.70(P< 0.05),见
项目 Items | 基因型 Genotypes | 样本量 Numbers/只 | 体质量 Mass/g | 壳长 Carapace length/mm | 步足长度 Leg length/mm | 步足长度/壳长 Leg length/ carapace length |
---|---|---|---|---|---|---|
野生群体 Wild population | AA | 49 |
116.22±55.8 |
55.75±7.3 |
41.64±5.9 |
0.75±0.0 |
GG | 98 |
137.39±53.1 |
58.93±6.7 |
41.19±5.7 |
0.70±0.0 | |
AG | 43 |
139.04±52.2 |
59.35±6.5 |
43.55±6.0 |
0.73±0.0 | |
养殖群体 Cultured population | AA | 17 | 242.06±39.03 | 70.60±2.57 | 50.64±3.70 |
0.72±0.0 |
GG | 42 | 234.33±51.86 | 70.20±4.40 | 49.19±4.82 |
0.70±0.0 | |
AG | 186 | 237.45±46.91 | 70.44±3.85 | 50.07±3.26 |
0.71±0.0 |
注: 表中不同小写字母表示组间存在显著差异(P< 0.05)。
Notes: Different lowercase letters in the table indicate significant differences between groups (P< 0.05).
中华绒螯蟹Kcna基因编码的蛋白具有1个BTB结构域和5个跨膜结构区,符合典型的电压门控钾离子通道蛋白结构特
Kcna基因在动物肌肉细胞发育和骨骼肌收缩中扮演着重要的分子调控角色,这已经得到了先前研究的证
目前,随着现代分子生物学和遗传学的不断发展,中华绒螯蟹分子育种技术也日益展开。陈义培
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