摘要
血红蛋白是高等生物血液循环系统中的关键组分,其功能障碍与贫血、心血管疾病等密切相关。南极冰鱼科(Channichthyidae)鱼类血液因缺乏功能性血红蛋白呈现白色,为研究血红蛋白的生物学功能提供了独特的模型。研究发现位于foxp1b基因上游的intergenic区域chr6:43629743-43629779可能作为关键因子参与鱼类血红蛋白生成,但其具体的调控功能尚不清楚。本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,以斑马鱼为模型构建了CNE敲除杂合突变体,并通过血红蛋白染色比较了野生型对照组与突变体斑马鱼的血红蛋白生成差异。结果表明,chr6:43629743-43629779的敲除显著降低了斑马鱼血红蛋白的生成。qRT-PCR分析结果表明,突变体斑马鱼foxp1b基因表达量显著低于野生型对照组。揭示了CNE通过调控下游基因表达从而调控血红蛋白生成的分子机制,提示CNE在血红蛋白生成中发挥了关键作用。
关键词
在高等生物的血液循环系统中,血红蛋白扮演着至关重要的角色,负责氧气的有效运输和释放,以维持组织和器官的正常功
长期以来,科研人员主要在基因编码层面对斑马鱼血红蛋白进行研
CRISPR/Cas9系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9)是一种基于细菌免疫机制的基因编辑技术,广泛应用于基因功能研究、基因治疗等领
研究使用的AB品系斑马鱼购于国家斑马鱼资源中心,斑马鱼养殖于上海海洋大学实验室,斑马鱼养殖循环系统购置于上海海圣设备有限公司。斑马鱼养殖过程中温度维持在26~29 ℃,pH控制在6.5~7.5,并保持水质的清洁与稳定,维护水质平衡。实验方案经上海海洋大学动物伦理委员会批准,并遵守中国科学技术部制定的《实验动物伦理待遇指南》。
通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到包含4种白血南极冰鱼在内的16种鱼类基因组,利用LASTZ软件,将包含4种白血南极冰鱼在内的16种鱼类基因组:青鳉Oryzias latipes (GCF_002234675.1),大刺鳅Mastacembelus armatus (GCA_900324485.2),绿鳍马面鲀Thamnaconus septentrionalis (GCA_ 00982 3395.1),黄金鲈Perca flavescens (GCF_004354835.1),三刺鱼Gasterosteus aculeatus (BROADS1),阿留申平鲉Sebastes aleutianus (GCA_916700875.1),鞍斑杜父鲈Cottoperca gobio (GCF_900634415.1),智利油南极鱼Eleginops maclovinus (GCA_039105255.1), 鳞头犬牙南极鱼Dissostichus mawson (GCA_011823955.1),伯氏肩孔南极鱼Trematomus bernacchii (GCF_902827165.1),真裸南极鱼Harpagifer antarcticus (GCA_ 90282 7135.1),尖头裸龙
Gymnodraco acuticeps (GCF_902827175.1),南乔治亚拟冰鱼Pseudochaenichthys georgianus (GCF_902827115.1),头带冰鱼Chaenocephalus aceratus (GCA_023974075.1),龙嘴雪冰鱼Chionodraco myersi (GCA_009756435.1),独角雪冰鱼Chionodraco hamatu
在Ensembl数据库(http://asia.ensembl.org/index.html)中检索获得斑马鱼chr6:43629743-43629779区域上下游各500 bp序列信息,并将序列导入Crisprscan (https://www. crisprscan. org/)在线网站进行敲除靶点设计。利用NCBI网站中的blast工具,对获得的4个chr6:43629743-43629779区域敲除靶点序列进行斑马鱼基因组的比对,以确定靶点特异性。chr6:43629743-43629779区域敲除靶点序列及突变体检测引物序列信息如
引物名称Primer name | 序列(5'-3') Sequence (5'-3') | 用途Application |
---|---|---|
chr6-TS1 | CCGAGAGATAAAATAGGTA | 基因敲除 |
chr6-TS2 | GGCGGTTTTGACTTCGGAAG | 基因敲除 |
chr6-TS3 | GGGCGTGTCAGCGTTCAAAA | 基因敲除 |
chr6-TS4 | GGAACGGCAGAATTGACGTCGGG | 基因敲除 |
chr6-F1 | GACAACATACGAGAGCATGGCTG | 突变体检测 |
chr6-R1 | CATTAGGGGCTGTCATCCTGC | 突变体检测 |
foxp1b-F1 | TCCAAACTACCTAGCAAGCG | qRT-PCR |
foxp1b-R1 | ATTCCTTTGGTCTCGTTGAGG | qRT-PCR |
β-actin-F | CGAGCTGTCTTCCCATCCA | 内参基因 |
β-actin-R | TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG | 内参基因 |
设计的4组sgRNA序列合成后,分别与scaffold序列进行PCR扩增以制备体外转录模板,PCR 条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,共34个循环;72 ℃延伸5 min,反应程序结束后于4 ℃保存。利用QIAquick PCR Purification试剂盒(Qiagen公司,货号:28104)对上述PCR产物进行纯化,并最终溶解于20 μL RNase free水中。利用T7 ULTRA体外转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific,货号:AM1314)对纯化后的PCR产物进行37 ℃孵育4 h,完成sgRNA的体外转录。转录产物经DNase消化20 min后,使用LiCl2完成对sgRNA的纯化。对sgRNA浓度进行测定后,分装保存于-80 ℃冰箱备用。
本研究所用的Cas9质粒由中国科学院水生生物研究所提供。Cas9质粒经限制性内切酶Hind Ⅲ 线性化后,利用mMACHINE™ T3 转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific,货号:AM1348)进行体外转录获得Cas9 mRNA,纯化测定浓度后,分装保存于-80 ℃冰箱备用。
sgRNA与Cas9 mRNA按照1∶4混合,并通过显微注射仪注入斑马鱼Ⅰ细胞期的动物极内,每个胚胎的注射剂量为1 ng/μL。针对chr6:43629743-43629779区域的4个靶点sgRNA,分别注射50枚胚胎,注射完成后放入28 ℃培养箱暂养。收集发育24 h后的斑马鱼胚胎,采用氢氧化钠法提取注射胚胎的基因组DNA,并利用突变体检测引物进行PCR扩增,检测成功突变个体。PCR反应体系:注射胚胎DNA模板1 μL,PCR Taq Mix (诺唯赞,货号:P112-02) 10 μL,chr6-F1/R1各1 μL,ddH2O 7 μL。反应条件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共34个循环;72 ℃延伸5 min后,于4 ℃保存。有效突变体利用上述PCR产物的T7E1酶切图谱进行鉴定,酶切产物以2%琼脂糖凝胶进行电泳,并统计chr6:43629743-43629779每个敲除靶点的基因编辑效率(突变胚胎数/总的胚胎数),选择敲除效率高的靶点进行后续chr6:43629743-43629779敲除实验和血红蛋白染色分析。
成熟红细胞的血红蛋白可以催化双氧水对二盐酸邻联茴香胺(O-dianisidine,Sigma公司,货号:D3252-5)的氧化反应而显示出铁锈色(偏红色),因此可综合胚胎的染色面积和平均光密度值来判断成熟红细胞的数
收集不少于10个发育至52 h的斑马鱼胚胎,采用500 μL Trizol(Thermo Fisher Scientific,货号:15596018CN)进行匀浆;在室温孵育后,加入200 μL氯仿,混合液振荡15 s后离心以分离各相;小心将上层水相(含RNA)转移至新试管中,并加入等体积的异丙醇以沉淀RNA;RNA沉淀用75%的乙醇洗涤,随后溶解于20 μL无RNase水中,使用NanoDrop分光光度计测量其浓度和质量。
将上述提取的RNA使用ABScript Neo RT Master Mix(Abclonal公司,货号:RK20433)进行逆转录。并采用SsoFast Eva Green Supermix(Bio-Rad,货号:1725200)在CFX Opus 96实时PCR系统(Bio-Rad)上进行qRT-PCR实验。PCR扩增程序:初始步骤95 ℃ 30 s,随后40个循环,每个循环95 ℃ 10 s及58 ℃ 30 s。引物序列详见
比较17种鱼类的基因组数据,结果显示chr6:43629743-43629779在4种白血南极冰鱼中特异性缺失了32 bp序列,而这些核心序列在斑马鱼等13种红血鱼类中均存在且保守度较高(
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图1 chr6:43629743-43629779的多序列比对以及转录因子预测
Fig.1 Multiple sequence alignment and transcription factor prediction of chr6:43629743-43629779
chr6:43629743-43629779在17种鱼类间进行序列比对,加粗的4种鱼类为“白血”南极冰鱼,橘色方框包含了预测转录因子的结合位点;黑框标出的是chr6:43629743-43629779具体缺失的32 bp核心差异序列。D.rerio 斑马鱼;O.latipes 青鳉;M.armatus 大刺鳅;T.septentrionalis 绿鳍马面鲀;P.flavescens 黄金鲈;G.aculeatus 三刺鱼;S.aleutianus 阿留申平鲉;C.gobio 鞍斑杜父鲈;E.maclovinus 智利油南极鱼;D.mawsoni 鳞头犬牙南极鱼;T.bernacchii 伯氏肩孔南极鱼;H.antarcticus 真裸南极鱼;G.acuticeps 尖头裸龙
;P.georgianus 南乔治亚拟冰鱼;C.aceratus 头带冰鱼;C.myersi 龙嘴雪冰鱼;C.hamatus 独角雪冰鱼。
The sequence chr6:43629743-43629779 was aligned across 17 fish species. The sequences of four species, highlighted in bold, represent "white-blooded" Antarctic icefish. The orange boxes indicate predicted transcription factor binding sites, while the blue box marks the specific 32 bp core deletion of chr6:43629743-43629779.D. rerio (zebrafish); O. latipes (medaka); M. armatus (tire track eel); T. septentrionalis (greenfin filefish); P. flavescens (yellow perch); G. aculeatus (three-spined stickleback); S. aleutianus (rougheye rockfish); C. gobio (channel bull blenny); E. maclovinus (patagonian blennie); D.mawsoni (Antarctic toothfish); T. bernacchii (emerald rockcod); H. antarcticus (Antarctic spiny plunderfish); G. acuticeps (ploughfish); P.georgianus (South Georgia icefish); C. aceratus (blackfin icefish); C. myersi (Myers′ icefish); and C. hamatus.
为了评估不同靶点(chr6-TS1-chr6-TS4)对chr6:43629743-43629779的敲除效率,分别收集4个靶点的斑马鱼注射胚胎进行PCR扩增和T7E1酶切,并以野生型斑马鱼胚胎样本作为阴性对照。结果如
![](html/shhy/20241204722/alternativeImage/EDCBE89F-7520-4e87-AFD3-AE76E982C494-F002.jpg)
图2 基于T7E1酶切评估不同靶点对chr6:43629743-43629779的敲除效率
Fig.2 Assessment of knockout efficiency of chr6:43629743-43629779 by different target sites using T7E1 digestion
M. 标准品Marker; WT. 野生型对照; PC. 阳性对照; 其中阳性对照为试剂盒中提供的Control template,用于验证T7E1酶切反应的有效性。
M. Standard Marker; WT. Wild type; PC. Positive control; The positive control is the control template provided in the kit, which is used to verify the effectiveness of the T7E1 enzyme cleavage reaction.
为了探明保守非编码元件chr6:43629743-43629779调控血红蛋白生成的功能,利用chr6-TS1完成了对斑马鱼chr6:43629743-43629779核心序列的敲除,并选取与血红蛋白生成无关的酪氨酸酶基因(tyr)敲除个体(Ctrl)和野生型胚胎(WT)作为对照。注射后的胚胎存活率如
组别Group | 总数Total number/个 | 12 h死亡数Number of deaths at 12 h/个 | 12 h存活数Number of survivors at 12 h/个 | 12 h存活率Survival rate at 12 h/% | 24 h死亡数 Number of deaths at 24 h/个 | 24 h存活数 Number of survivors at 24 h/个 | 24 h存活率Survival rate at 24 h/% |
---|---|---|---|---|---|---|---|
野生型对照WT | 100 | 1 | 99 | 99 | 3 | 97 | 97 |
敲除个体Ctrl | 50 | 2 | 48 | 96 | 5 | 45 | 90 |
chr6-TS1 | 60 | 3 | 57 | 95 | 3 | 57 | 95 |
胚胎发育52 h后,收集WT、Ctrl、TS1组胚胎各20枚进行血红蛋白染色(
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图3 WT、Ctrl及TS1组斑马鱼胚胎的O-dianisidine染色
Fig.3 O-dianisidine staining of wild-type, control group, and TS1 group zebrafish embryos
TS1. chr6:43629743-43629779敲除组;WT. 野生型;Ctrl. 酪氨酸酶基因(tyr)敲除组;O-D . O-dianisidine 血红蛋白染色;52 hpf为进行血红蛋白染色实验时斑马鱼个体的发育时间;右下角的数字为有表型个体与该组总个体数量比;比例尺:100 mm。
TS1. chr6:43629743-43629779 knockout group; WT. wild-type; Ctrl. tyrosinase gene (tyr) knockout group; O-D. O-dianisidine hemoglobin staining; 52 hpf indicates the developmental stage of zebrafish embryos during the hemoglobin staining experiment; the number in the bottom-right corner represents the ratio of phenotypic individuals to the total number of individuals in the group; scale bar: 100 mm.
![](html/shhy/20241204722/alternativeImage/EDCBE89F-7520-4e87-AFD3-AE76E982C494-F004.jpg)
图4 WT、Ctrl、TS1组血红蛋白染色情况差异性分析
Fig.4 Differential analysis of hemoglobin staining in WT, Ctrl, and TS1 groups
ns表示无显著性差异(P>0.05);*表示有显著性差异(P<0.05);**表示有显著性差异(P<0.01);***表示有显著性差异(P<0.001)。
ns indicates that there is no significant difference((P>0.05) ; * indicates significant difference(P<0.05) ; ** indicates significant difference(P<0.01) ;*** indicates significant difference(P<0.001).
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图5 WT组与TS1-S组测序峰图
Fig.5 Sequencing Chromatograms of WT Group and TS1-S Group
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图6 TS1-S及TS1-F组斑马鱼胚胎的O-dianisidine染色
Fig.6 O-dianisidine staining of TS1-S and TS1-F group zebrafish embryos
TS1-S. chr6:43629743-43629779敲除成功组;TS1-F. chr6:43629743-43629779敲除失败组;O-D. O-dianisidine血红蛋白染色;52 hpf为进行血红蛋白染色实验时斑马鱼个体的发育时间;右下角的数字为有表型个体与该组总个体数量比;比例尺:100 mm。
TS1-S. chr6:43629743-43629779 successful knockout group; TS1-F. chr6:43629743-43629779 failed knockout group; O-D. O-dianisidine hemoglobin staining; 52 hpf indicates the developmental stage of zebrafish embryos during the hemoglobin staining experiment; the number in the bottom-right corner represents the ratio of phenotypic individuals to the total number of individuals in the group; scale bar: 100 mm.
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图7 TS1-F组与TSI-S组血红蛋白染色情况差异性分析
Fig.7 Differential analysis of hemoglobin staining between TS1-F group and TS1-S group
ns表示无显著性差异(P>0.05);**表示有显著性差异(P<0.01);****表示有显著性差异(P<0.000 1)。
ns indicates that there is no significant difference((P>0.05) ; ** indicates significant difference(P<0.01) ; **** indicates significant difference(P<0.000 1).
为探究chr6:43629743-43629779区域下游第一个基因foxp1b在chr6:43629743-43629779敲除成功组(TS1-S)与野生型组(WT)中的表达差异,通过qRT-PCR对TS1-S与WT组进行了分析,结果显示,与WT组相比,TS1-S组foxp1b基因表达量下降了约20%,且具有显著性差异(
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图8 WT组与TS1-S组foxp1b基因相对表达量
Fig.8 Relative expression of foxp1b gene in WT and TS1-S groups
**表示有显著性差异(P<0.01)。
** indicates significant difference(P<0.01) .
虽然编码基因的功能在基因遗传中非常重要,但是调控其表达的非编码DNA调控元件同样也是破译不同生命活动过程中遗传密码的重要部分。其中,保守非编码元件CNE因其高于蛋白编码序列的保守性,在揭示物种间古老性状的演化机制中具有重要意
同样,南极冰鱼血红蛋白的缺失作为一种独特的表型,可能也与特定的CNE相关。这一假设为探索血红蛋白生成的调控机制提供了新的研究方向。在南极冰鱼血红蛋白生成的研究中,DAANE
本研究以斑马鱼上位于foxp1b基因上游的intergenic区域chr6:43629743-43629779为研究对象,待斑马鱼胚胎在28 ℃正常发育52 h后,对实验组、阴性对照组及野生型对照组分别进行血红蛋白染色实验。进行血红蛋白染色的3组胚胎均产自同一对亲本,其中WT为野生型对照,未做任何处理;Ctrl组为注射了tyr敲除靶点的对照,目的在于排除注射对血红蛋白带来的影响。各组之间的血红蛋白染色情况比较包括染色面积、染色平均光密度值,染色积分光密度值。通过比较野生型(WT)、对照组(Ctrl)以及chr6:43629743-43629779敲除组胚胎的血红蛋白染色情况,结果显示,chr6:43629743-43629779敲除组胚胎的血红蛋白染色平均光密度值显著低于WT组和Ctrl组。然而,敲除组的血红蛋白染色面积以及染色积分光密度值与WT组和Ctrl组均无显著差异。进一步对chr6:43629743-43629779敲除组胚胎进行基因型鉴定后,将敲除成功组(TS1-S)与敲除失败组(TS1-F)的血红蛋白染色情况进行比较。结果显示,TS1-S的染色平均光密度值及染色积分光密度值均显著低于TS1-F,但两组之间的染色面积差异不显著。这可能是由于斑马鱼的血红蛋白主要分布在血管密集的心脏及胸腹部区域,而chr6:43629743-43629779的成功敲除虽然对血红蛋白生成产生了显著影响,但血红蛋白的生成通常依赖于复杂的基因调控网络,单一CNE对血红蛋白生成的影响有限,因此TS1-S与TS1-F在血红蛋白染色面积上未表现出显著差异。此外,通过对实验组与野生型对照组斑马鱼胚胎在发育至52 h后进行定量分析,发现实验组中foxp1b基因的表达水平显著低于对照组。这一结果进一步提示chr6:43629743-43629779可能通过调控foxp1b基因表达,从而在斑马鱼血红蛋白生成过程中发挥作用。
血红蛋白生成的调控网络是多层次的,不仅需要分析单个CNE的功能,还需要关注与其他元件的协同作用。随着组学技术的快速发展,快速识别与血红蛋白生成相关的CNE成为可能。例如,通过全基因组比对,可以在南极冰鱼、红血南极鱼和模式生物斑马鱼等多物种间识别保守的非编码序列,利用大规模平行报告基因分析(Massively parallel reporter assay, MPRA)对筛选出的CNE进行高通量鉴
综上所述,研究CNE对斑马鱼血红蛋白生成具有重要意义。未来需整合多种组学技术,结合功能验证手段,从全局和动态视角全面解析CNE在血红蛋白生成和基因调控网络中的作用,为揭示极端环境适应性生物学性状的分子机制提供重要基础,也为血液疾病的研究和治疗提供新思路。
利益冲突
作者声明本文无利益冲突
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