摘要
为了探究水流对鱼类体色的影响，比较了不同流速水流养殖下斑马鱼皮肤黑色素细胞数量和基因的表达，结果表明：相对于低流速（0.010 m/s），在高流速（0.022 m/s）下养殖斑马鱼3个月后，皮肤黑色素细胞数量显著增加，尤其是鱼体尾部区域；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）结果显示高流速组斑马鱼皮肤黑色素细胞标记基因kita、mitfa和tyrp1a相对表达量显著升高，黄色素细胞标记基因csf1ra显著降低，虹彩细胞标记基因pnp4a无显著变化，表明高流速水流诱导黑色素细胞而抑制黄色素细胞的形成。RT-qPCR结果显示，相比于低流速组，高流速组斑马鱼皮肤中黑色素细胞形成抑制因子基因asip1的相对表达量显著减少，与黑色素细胞形成相关的黑皮质素受体基因mc1r、阿黑皮素原基因pomca无显著性变化，视黄酸合成相关的视黄醛脱氢酶基因raldh2和raldh3显著下调，提示水流刺激可通过降低asip1的表达来诱导黑色素细胞形成；水流刺激瞬时受体通道蛋白基因trpv4和压电式机械敏感通道蛋白基因piezo2的表达上调，而piezo1无显著性变化。以上结果表明，水流能诱导斑马鱼黑色素细胞的形成，可能是通过皮肤机械力感受蛋白Trpv4或Piezo2介导水流刺激减少asip1表达的结果。Asip1除了调控黑色素细胞形成以外还调控脂肪的积累，相比于低流速组，高流速组斑马鱼肥满度也显著下降，GO富集分析显示差异表达基因主要富集到甘油三酯分解代谢、高密度脂蛋白颗粒、脂质结合等条目，差异表达基因显著富集的KEGG通路有：氨基糖和核苷酸糖的代谢、PPAR信号通路、亚油酸代谢、花生四烯酸代谢等。RT-qPCR检测与脂肪代谢相关的脂肪酸过饱和酶2基因fads2显著上调，瘦素基因lep无显著性差异，提示水流可能通过Asip1影响Fads2进而影响脂肪降解。本研究首次报道了水流对鱼类体色的影响，为理解目前越来越普遍的流水养殖对鱼类体色和肥满度的影响提供了初步的理论基础。
高密度的鱼类养殖越来越普遍，无论是工厂化的开放流水模式和循环水模式，还是室外池塘跑道式流水养殖
为了探究水流是否影响鱼类体色的形成，本研究以模式生物斑马鱼为实验对象，比较在不同强度的水流刺激下斑马鱼色素细胞数量的差异及相关基因的表达，初步探究水流对斑马鱼体色的影响，为后续方便利用基因敲除技术开展分子机制研究奠定基础。
本研究所用的野生型斑马鱼饲养于上海海洋大学本实验室。选取40日龄的斑马鱼仔鱼进行水流实验。本研究中所有样本采集、实验流程、研究方法均严格按照《上海海洋大学实验室动物伦理规范》和上海海洋大学伦理委员会制定的规章制度执行。
实验在斑马鱼循环水系统中进行，设置高流速组（实验组）和低流速组（对照组）各3个平行，每个平行20尾，共120尾。通过控制出水阀门的大小设置流速大小，使用流速仪（LS300-A，1.5%，福建徕斯达）检测出水口水体流速，高流速组流速为0.022 m/s，低流速组流速为0.010 m/s。光照周期为14 h，水流处理时长为90 d。
取处理时长90 d的斑马鱼，高流速组和低流速组随机各选取9尾，使用浓度为1.5 g/L的3-乙氧酰基苯胺甲硫酸盐（MS-222）溶液进行麻醉，置于蔡司体视镜1×视野下拍照。使用Adobe Photoshop 2020按照实际直尺和斑马鱼皮肤在同一倍数下等比例放大的原理，划定合适大小的画框，画框对应实际面积为0.02 m
取处理时长90 d的斑马鱼，高流速组和低流速组随机各选取9尾，使用浓度为1.5 g/L的MS-222溶液进行麻醉，电子天平（JA3003，上海舜宇恒平科学仪器有限公司）称重后使用卷尺（DL9010B，得力）测量体长。肥满度计算公式为体质量与体长的立方的比值。使用GraphPad Prism 9.0.0软件进行T-Test（unpaired）分析。
取处理时长90 d的斑马鱼，每平行随机取2尾，高流速组和低流速组各6尾斑马鱼，使用1.5 g/L的MS-222溶液对其进行麻醉，取同一侧皮肤，液氮速冻后储存在-80 ℃。Trizol法提取皮肤总RNA。将3个平行样混合送至上海欧易生物医学科技有限公司，质检合格后在illumina Novase
统计每个GO条目中所包括的差异表达基因个数，并用超几何分布算法计算每个GO条目中差异表达基因富集的显著性，利用Fisher精确检验计算生物过程Biological Process（BP）、细胞组分Cellular Component（CC）、分子功能Molecular Function（MF）中的每个Term。
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）是有关Pathway的主要公共数据库，利用KEGG数据库对差异蛋白编码基因进行Pathway分析（结合KEGG注释结果），并用超几何分布检验的方法计算每个Pathway条目中差异表达基因富集的显著性。
使用HiSli
用斑马鱼β-肌动蛋白基因β-actin作为实时荧光定量PCR实验的内参基
| 引物 Primer | 引物序列(5'- 3') Primer sequence | 退火温度 Annealing temperature/℃ | 长度 Length/bp |
|---|---|---|---|
| kita-F | AGTGCGTCTCAAGGTGTCAG | 60 | 143 |
| kita-R | GCACTTGTCCATCAATCGGC | ||
| mitfa-F | CCTCTGAGATGATGGCGTGT | 60 | 251 |
| mitfa-R | TTTGCCGCCAATGAAACCAC | ||
| tyrp1a-F | GCAGTCGACTTCAGTCACGA | 60 | 260 |
| tyrp1a-R | TAGTCCTCCACACTCTCGCA | ||
| csf1ra-F | AGACTACATTTGCTGCGCTA | 60 | 484 |
| csf1ra-R | TTCGATCAAAACCCCGAGA | ||
| pnp4a-F | TCAAGTGCCAGGACTCGTTC | 60 | 413 |
| pnp4a-R | CTTACAGATGTCCAGCGCCA | ||
| asip1-F | CATGCCAATGGAGGAACAGC | 60 | 194 |
| asip1-R | GCACACAGTTCGGCGGAG | ||
| pomca-F | GCCCCTGAACAGATAGAGCC | 60 | 192 |
| pomca-R | CTCGTTATTTGCCAGCTCGC | ||
| mc1r-F | GCTTGCCAGCATCACCTCTA | 60 | 145 |
| mc1r-R | GTGGACATGGGCCAAGATGA | ||
| raldh2-F | GAGAGGTGAAGAACGACCCG | 60 | 150 |
| raldh2-R | GGTTGTACGTGGGGAAGACC | ||
| raldh3-F | TCAAGCCGCGGAAGGTTATT | 60 | 199 |
| raldh3-R | CATCGACCGGCATGGTTTTC | ||
| trpv4-F | CAGTATCTTCAGTCCCACGAA | 60 | 256 |
| trpv4-R | GCTCCACATACTGTTTGCATC | ||
| piezo1-F | AGGATGTTCAATCATAACTCGG | 60 | 208 |
| piezo1-R | AGTCCATCACAGCTCGAAG | ||
| piezo2-F | GCGTTATTATTGTCTGCAAGCTC | 60 | 200 |
| piezo2-R | CAGGTTAGGCAATATTATCCCA | ||
| Lep-F | CATCATCGTCAGAATCAGGG | 60 | 199 |
| Lep-R | ATCTCGGCGTATCTGGTCAA | ||
| fads2-F | TCAGCGGACACCTCAACTTC | 60 | 149 |
| fads2-R | CGCAAATGCTCCGTACAAGG | ||
| β-actin-F | AGGTCATCACCATTGGCAAT | 60 | 131 |
| β-actin-R | GATGTCGACGTCACACTTCAT |
对高流速组和低流速组斑马鱼身体不同部位皮肤的黑色素细胞的数量进行统计，发现相比于低流速组，高流速组在身体后半段处黑色素细胞数量显著增多（图版），具体为1、2、3、4、5处显著增多，在6、7处无明显变化（
图版 高流速和低流速组斑马鱼整体观及身体中部和尾部局部观
Plate The overall view and the localized view of the middle and tail of the body of zebrafish between the high flow group and low flow group
1、4表示高流速组和低流速组斑马鱼整体观；2、5表示高流速组和低流速组斑马鱼身体中部局部观；3、6表示高流速组和低流速组斑马鱼身体尾部局部观。
Number 1 and 4 represent the overall view of zebrafish in the high flow and low flow group；Number 2 and 5 represent the localized view of themiddle part of the body of zebrafish in the high flow and low flow group；Number 3 and 6 represent the localized view of the tail of the body ofzebrafish in the high flow and low flow group.
图1 高流速组和低流速组斑马鱼各部位黑色素细胞数量
Fig. 1 Number of melanophores of zebrafish in different parts of body between two different flow rate groups
（a）黑色素细胞计数部位，1-7表示选取的具体位置;（b）黑色素细胞计数结果；ns.无显著差异； *P<0.05； **P<0.01。
（a）Count site of melanophore，1-7 represent the specific selected site;（b）Result of melanophore count；ns.No significant difference； *P<0.05；**P<0.01.
由于黄色素细胞和红彩细胞难以在显微镜下直接观察统计，故采用RT-qPCR检测斑马鱼皮肤中黄色素细胞和虹彩细胞的标记基因csf1ra和虹彩细胞的标记基因pnp4a的表达，来比较其受水流的影响。相比于低流速组，csf1ra的表达显著降低，pnp4a无显著性变化，黑色素细胞标记基因mitfa、kita和tyrp1的表达量在高流速组斑马鱼皮肤中均显著上升，表明高流速水促进斑马鱼黑色素细胞的形成而抑制黄色素细胞的形成，结果符合黑色素细胞数量增多的统计结果（
图2 高流速组和低流速组斑马鱼皮肤中色素细胞标记基因的相对表达量
Fig.2 The relative expression of marker genes for pigment cells in zebrafish skin between two different flow rate groups
ns. 无显著差异； *P<0.05； **P<0.01； ***P<0.001。
ns. No significant difference； *P<0.05； **P<0.01； ***P<0.001.
为了解高流速水流影响了哪些黑色素细胞发育的上游因子和是否通过视黄酸来介导黑色素细胞的形成，对促黑激素α-msh的前体蛋白阿黑皮素原基因pomca、黑色素细胞形成抑制因子基因asip1、黑皮质素受体基因mc1r、视黄酸合成酶基因raldh2/3的表达进行检测，相比于低流速组，高流速组pomca基因的表达无显著性变化，asip1显著降低，mc1r无显著性变化，raldh2和raldh3均显著降低（
图3 高流速组和低流速组斑马鱼皮肤中黑色素细胞发育相关基因的相对表达量
Fig.3 Relative expression of genes related to melanophore development in zebrafish skin between two different flow rate groups
ns. 无显著差异； *P<0.05； **P<0.01。
ns. No significant difference； *P<0.05； **P<0.01.
为了解水流通过哪些机械力感受蛋白来影响黑色素细胞的调控，通过RT-qPCR对斑马鱼皮肤中机械力感受蛋白基因trpv4、piezo1/2的表达进行检测，结果显示，相比于低流速组，高流速组trpv4和piezo2显著上调，piezo1无显著变化（
图4 高流速组和低流速组斑马鱼皮肤中机械力感受蛋白基因的相对表达量
Fig.4 The relative gene expression of mechanosensitive protein in zebrafish skin between two different flow rate groups
ns. 无显著差异； *P<0.05； **P<0.01。
ns. No significant difference； *P<0.05； **P<0.01.
为了进一步了解水流对皮肤组织的影响，比较分析了高流速组和低流速组斑马鱼的同一侧皮肤的转录组。转录组测序结果显示共检测到21 403个基因，选择q-value＜0.05&|log2fold change|＞1的作为差异表达基因，相比于低流速组，检测到高流速组斑马鱼皮肤中有44个基因表达量显著上调，37个基因表达量显著下调。同时，将黑色素细胞形成相关基因RT-qPCR检测结果与转录组中log2（Fold Change）值进行了比较发现，相比于低流速组，在高流速组中的变化趋势一致（
图5 高流速组和低流速组斑马鱼皮肤转录组分析
Fig.5 Transcriptome analysis of zebrafish skin between two different flow rate groups
（a） 黑色素细胞形成相关基因RNA-Seq与RT-qPCR验证结果；（b） GO富集分析结果；（c）KEGG通路富集分析结果。
（a） Validation results of RNA-Seq and RT-qPCR for melanocyte formation-related genes； （b） GO enrichment analysis results；（c） KEGG pathway enrichment analysis results.
对差异表达基因进行GO富集分析，发现在BP水平上，差异表达基因主要富集在胆固醇酯化的正向调节（Positive regulation of cholesterol esterification）、甘油三酯分解代谢（Triglyceride catabolic process）、高密度脂蛋白颗粒组装（High-density lipoprotein particle assembly）等条目；在CC水平上，差异表达基因主要富集在高密度脂蛋白颗粒（High-density lipoprotein particle）、乳糜微滴（Chylomicron）、细胞外区域（Extracellular region）等条目；在MF水平上，差异表达基因主要富集在磷脂酰胆碱-甾醇o酰基转移酶激活剂活性（Phosphatidylcholine-sterol O-acyltransferase activator activity）、胆固醇结合（Cholesterol binding）、脂质结合（Lipid binding）等条目（
由于Asip1除了在体色调控中发挥作用，还被认为参与调节能量平衡、体质量增长和诱导肥胖，此外，转录组的GO和KEGG也富集了脂代谢相关条目和通路（
图6 高流速组和低流速组斑马鱼肥满度和皮肤脂肪代谢相关基因的相对表达量
Fig.6 Zebrafish fullness and relative expression of genes related to skin fat metabolism in zebrafish skin between two different flow rate groups
（a）斑马鱼肥满度；（b）脂肪酸过饱和酶基因fads2和瘦素基因lep的相对表达量； ns. 无显著差异； **P<0.01； ***P<0.001。
（a）Zebrafish fullness； （b）Relative expression of genes fads2 and lep； ns. No significant difference； **P<0.01； ***P<0.001.
本研究设置了两种流速差异明显的斑马鱼养殖环境，发现高流速组斑马鱼体表的黑色素细胞数量相比低流速组明显更多，黑色素细胞标记基因kita、mitfa和tyrp1a的表达也显著上升，黄色素细胞标记基因csf1ra的表达则显著减少而虹彩细胞的标记基因则无显著性变化，说明强水流刺激能诱导斑马鱼黑色素细胞的形成而抑制黄色素细胞的形成。色素细胞的发育调控模式并非单一，有众多研究报道黑色素细胞、黄色素细胞以及虹彩细胞之间存在相互作用，所以其受水流影响的调控机制还需要进一步研究。
通过比较身体不同部位黑色素细胞数量的差异，发现高流速组和低流速组之间的黑色素细胞数目的差异体现在斑马鱼身体的后半部分，推测跟皮肤表面接受到的水流刺激强度不均一有关。高流速组的斑马鱼在鱼缸中尾部摆动要更为剧烈，身体后半段接收到的水流刺激相对更多。研究发现大黄鱼身体后半段栉鳞显著多于前半段身
Pomc为阿黑皮素原，经过转录翻译后剪切产生的促黑激素α-MSH能和黑皮质素受体Mc1r结合启动下游通路，促进黑色素细胞的发
在本研究中，检测到piezo2和trpv4在高流速组中上调，而piezo1无显著变化，表明高流速水流促进了斑马鱼皮肤中trpv4和piezo2表达，提示皮肤可能通过trpv4和piezo2来响应水流产生的机械刺激。研究发现半滑舌鳎通过无眼侧和有眼侧头部皮肤上大量游离的神经丘中的瞬时受体电位通道蛋白Trpv4能感知周围水流的变化而发挥机械感觉的功
肥满度是反映鱼类生长和肥瘦的指标，本研究发现高流速组斑马鱼肥满度显著低于低流速组，与已报道的高流速海流下养殖的越冬大黄鱼的肥满度显著降低的结果相一
对高流速组和低流速组斑马鱼的皮肤进行转录组测序，差异表达基因的GO和KEGG富集分析结果显示差异基因富集在甘油三酯分解代谢、脂质结合、花生四烯酸代谢、PPAR信号通路等脂类代谢和脂肪酸相关条目和通路上，说明高流速水流在改变斑马鱼机体脂肪的代谢和积累的同时，还对皮肤脂肪的代谢产生了影响。有研究表明Asip1参与能量代谢、体质量增长以及肥胖诱导的调
综上所述，本实验首次报道水流刺激能诱导斑马鱼黑色素细胞，其可能的机制是皮肤中的机械力感受蛋白Trpv4或Piezo2在接受到水流机械刺激后下调asip1，促进了黑色素细胞的形成，明确其分子机制有待将来进一步的研究，同时高流速养殖也降低了斑马鱼的肥满度，为越来越普遍的流水养殖对鱼类肥满度的影响提供理论基础。
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