摘要
为探究低氧-复氧胁迫对罗氏沼虾仔虾存活及机体抗氧化因子的影响，分别将罗氏沼虾仔虾放入溶解氧浓度为1.0、1.2和1.4 mg/L的水体中进行胁迫，测定并估算胁迫开始后第4、8、12、24、48和72小时存活率及半致死浓度（LC50）；随后将罗氏沼虾仔虾重新放入溶解氧浓度为2.2 mg/L的水体中进行低氧胁迫72 h后，再将水体溶解氧浓度在4 h内恢复至6.0 mg/L、12 h内恢复至8.4 mg/L，测定低氧胁迫第0、4、8、12、24、48、72小时以及复氧胁迫后第4、12小时鳃、肝胰腺及肌肉组织中抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX）、磷酸水解酶（AKP、ACP）活力及丙二醛（MDA）含量。结果表明，罗氏沼虾仔虾在3种低氧浓度胁迫下死亡率及LC50值均随胁迫时间延长而逐渐上升，且低氧胁迫后第12、24小时死亡率显著高于第4、8小时死亡率（P<0.05）。在低氧胁迫0至72 h时，罗氏沼虾仔虾鳃、肝胰腺和肌肉组织SOD、CAT和GSH-PX活力呈现先上升后显著降低（P<0.05）、复氧胁迫后又显著上升的变化趋势（P<0.05）；在低氧胁迫72 h后再复氧胁迫时，肝胰腺AKP、ACP活性显著高于鳃、肌肉组织，且AKP、ACP活力均呈现低氧胁迫时先显著上升（P<0.05）后逐步降低、复氧后先降低再上升的变化趋势；鳃、肝胰腺和肌肉中组织MDA含量呈现先上升而后不断降低直至复氧后再次回升；在低氧胁迫12~24 h时，鳃、肝胰腺、肌肉组织中SOD、CAT和GSH-PX活力的上升及下降均发生显著变化（P<0.05）。综上所述，低氧及低氧-复氧胁迫均影响了罗氏沼虾仔虾存活及抗氧化能力，且低氧胁迫后第12~24小时为罗氏沼虾仔虾应激响应的关键时间点，研究结果将为揭示罗氏沼虾低氧及低氧-复氧胁迫下生理生化响应机制提供基础理论参考。
近年来，全球气候变暖导致大气温度上升，必然引起自然水体温度上升，这将直接引起水体溶解氧（Dissolved oxygen，DO）水平降
罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）自然分布于印度洋、太平洋区域热带和亚热带地区的淡水或咸淡水水域
近年来已有不少关于水生动物低氧-复氧胁迫的研究，如赵思哲
试验所用罗氏沼虾仔虾均来自于江苏鼎和水产科技发展有限公司苗种生产基地，随机选取健康的罗氏沼虾仔虾［平均体长（2.1±0.1）cm、平均体质量（0.13±0.01）g］300尾，分别暂养于3个直径为1 m、水深30 cm的聚乙烯圆桶内，养殖密度约为127尾/
选取平均全长为（2.1±0.1）cm的罗氏沼虾仔虾90尾于3个直径为1 m的聚乙烯圆桶内。暂养72 h后，随机选取30尾仔虾放入3个20 L养殖桶，在对水体中快速通入N2直至50%受试仔虾沉底附肢不动，此时溶解氧浓度即为溶解氧临界窒息点。使用便携式溶氧测定仪测得25 ℃下的罗氏沼虾仔虾溶解氧窒息点为0.89 mg/L。
根据预试验中仔虾DO窒息浓度0.89 mg/L进行设计，设置1.0、1.2、1.4 mg/L 3个浓度梯度，每个梯度设置3个平行， 每个平行随机取30尾罗氏沼虾仔虾放入20 L养殖桶，通入N2进行胁迫以进行半致死浓度（LC50）实验，实验过程不投喂饵料。实验开始后通过控制N2使溶氧浓度稳定在既定水平，并分别在第4、8、12、24、48和72小时记录各个重复处理组的死亡个体数。将沉底附肢不动的仔虾视为死亡，计算出各个时间点仔虾的死亡率，使用Karber
| LC50=lo | （1） |
式中： Xm为最低溶解氧组溶解氧的对数值；i为相邻两溶解氧组对数值之差；P为各组仔虾的死亡率；∑P为各组仔虾死亡率之和。
暂养72 h后，另选90尾罗氏沼虾仔虾放于3个充分曝气的直径为1 m、水深30 cm的聚乙烯圆桶中，停止对养殖桶内水体通入空气并朝水中持续充入纯N2，在4 h内将水体溶解氧浓度降至并稳定在2.2 mg/L，保持72 h持续低氧胁迫；随后停止通入N2并开始充入纯氧进行复氧胁迫，将溶解氧浓度在4 h内恢复至6.0 mg/L、12 h内恢复至8.4 mg/L。胁迫处理期间氨氮维持在0.6 mg/L以下，温度保持在25 ℃，不投喂饵料。
分别在低氧胁迫第0（对照组）、4、8、12、24、48、72小时及复氧后第4、12小时，从3个养殖桶内挑选9尾行动能力相对较弱的仔虾，快速解剖并采集鳃、肝胰腺、肌肉组织，每3尾虾的相同组织混合存放于1.5 mL离心管中，将含所采集组织的离心管置放于液氮速冻，随后快速转移至-80 ℃冰箱中进行低温保存，用于酶活力测定。
准确称取罗氏沼虾仔虾鳃、肝胰腺和肌肉等组织，按质量体积比1∶9的比例加入0.9%生理盐水，使用组织匀浆机在冰水浴条件下充分匀浆1 min，随后在4 ℃、2 500 r/min的条件下离心10 min并取上清液，使用南京建成生物工程研究所生产的相关试剂盒并按照说明书使用酶标仪（BIOTEK Synergy H1，美国）进行过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）的活力及丙二醛（MDA）的含量测定，所有抗氧化因子水平测定取3个生物学重复。
急性低氧处理引起罗氏沼虾仔虾不同程度的死亡，死亡率统计结果如
时间点 Time point/h | 死亡率Mortality/% | 半致死浓度 LC50/（mg/L） | ||
|---|---|---|---|---|
| 1.0 mg/L | 1.2 mg/L | 1.4 mg/L | ||
| 4 |
0.02±0.0 |
0.00±0.0 |
0.00±0.0 | 0.472 |
| 8 |
0.12±0.0 |
0.01±0.0 |
0.00±0.0 | 0.735 |
| 12 |
0.19±0.0 |
0.04±0.0 |
0.01±0.0 | 0.813 |
| 24 |
0.42±0.0 |
0.08±0.0 |
0.07±0.0 | 0.938 |
| 48 |
0.63±0.1 |
0.09±0.0 |
0.07±0.0 | 1.036 |
| 72 |
0.77±0.1 |
0.22±0.0 |
0.08±0.0 | 1.101 |
注： 表格中的不同大写字母表示同一时间点内各组间的差异显著（P<0.05），不同小写字母表示同一个实验组在不同时间点的差异显著（P<0.05）。
Notes： The different uppercase letters in the table indicate significant differences between groups at the same time point（P<0.05）， while different lowercase letters indicate significant differences in the same experimental group at different time points（P<0.05）.
根据1.0、1.2、1.4 mg/L下各时间点的罗氏沼虾仔虾死亡率计算得罗氏沼虾仔虾4、8、12、24、48和72 h的LC50值分别为 0.472、0.735、0.813、0.938、1.036、1.101和1.134 mg/L。发现半致死浓度随着低氧胁迫时间的增长而不断升高，且低氧胁迫8 h LC50值相对胁迫4 h显著升高，低氧胁迫8~72 h LC50值缓慢增加。
罗氏沼虾仔虾鳃、肝胰腺和肌肉组织中CAT、GSH-PX、SOD的活力在低氧-复氧胁迫中都呈现先升高、低氧胁迫12~24 h内显著下降（P<0.05），随后活力不断下降，复氧胁迫阶段又升高至对照组活力水平（P>0.05）的趋势，其活力变化过程由见
图1 低氧-复氧胁迫对罗氏沼虾仔虾鳃、肝胰腺及肌肉中CAT、SOD、GSH-PX活力的影响
Fig.1 Effects of hypoxia-reoxygenation stress on CAT，SOD，GSH-PX activity in gills， hepatopancreas and muscles of M.rosenbergii larvae
同一时间点内不同上标字母表示组间的差异显著（P<0.05）。
Different superscripts at the same time point indicate significant differences between groups（P<0.05）.
罗氏沼虾仔虾经低氧胁迫后，肝胰腺CAT、SOD、GSH-PX相对鳃及肌肉组织中全时期活力最高。开始低氧胁迫后，罗氏沼虾仔虾肝胰腺中CAT、SOD、GSH-PX活力缓慢上升，其中GSH-PX在低氧胁迫12 h活力显著上升（P<0.05）；24 h以后，CAT、SOD、GSH-PX活力在肝胰腺中开始逐渐下降，并在72 h下降至活性最低点；复氧胁迫4 h后，CAT、SOD、GSH-PX在肝胰腺中的活力恢复至对照组水平（P<0.05），且CAT、SOD、GSH-PX在复氧胁迫12 h活力不再发生显著水平变化。
罗氏沼虾仔虾肌肉组织SOD、GSH-PX活力变化趋势呈现先上升后下降、复氧后先上升再下降的趋势，而CAT活力在低氧胁迫后持续下降至最低水平，复氧后便开始上升；低氧胁迫开始后，4 h肌肉组织CAT活力显著下降（P<0.05），随后持续下降直至72 h达到活力最低水平。而肌肉组织SOD、GSH-PX活力在低氧胁迫后发生上升，在8 h发生活力显著上升（P<0.05），在24 h肌肉组织SOD、GSH-PX活力开始下降， 随后持续下降直至72 h达到活力最低水平。复氧胁迫后，肌肉组织CAT活力逐渐上升，在复氧胁迫12 h恢复至对照组水平（P>0.05），GSH-PX、SOD活力先上升后下降，其中GSH-PX活力在复氧胁迫4 h显著上升（P<0.05），复氧胁迫12 h下降至对照组水平（P>0.05）。
罗氏沼虾仔虾中ACP、AKP活力在肝胰腺、鳃、肌肉中的活力呈随低氧胁迫时间先上升、后下降，复氧胁迫后先下降再上升的变化趋势，其活力变化过程见
图2 低氧-复氧胁迫对罗氏沼虾仔虾鳃、肝胰腺及肌肉中ACP、AKP活力的影响
Fig.2 Effect of hypoxia and reoxygenation on ACP，AKP activity in in gills， hepatopancreas and muscles of
同一时间点内不同上标字母表示组间的差异显著（P<0.05）。
Different superscripts at the same time point indicate significant differences between groups（P<0.05）.
;M.rosenbergii larvae
MDA在鳃、肝胰腺、肌肉中的含量在仔虾经受低氧胁迫后先上升后下降，并在复氧胁迫后有所回升，低氧胁迫12~24 h时，MDA在肝胰腺中的含量显著上升，其活力变化过程由
图3 低氧-复氧胁迫对罗氏沼虾仔虾各组织中MDA含量的影响
Fig.3 Effect of hypoxia and reoxygenation on MDA content in different tissues of M. rosenbergii larvae
同一时间点内不同上标字母表示组间的差异显著（P<0.05）。
Different superscripts at the same time point indicate significant differences between groups（P<0.05）.
甲壳动物中对低氧耐受能力因种类而异，其中虾类的耐低氧能力一般低于蟹类，如中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）和锯缘青蟹（Scylla serrata）幼蟹的低氧窒息点分别为0.21和0.17 mg/L，而中国明对虾（Penaeus chinensis）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）低氧窒息点分别为0.74和1.27 mg/
本研究发现低氧胁迫时间延长后死亡率上升更为显著，这可能与仔虾对O2的依赖程度以及低氧环境下细胞代谢的变化有关。当仔虾处于低氧胁迫状态时，细胞呼吸、能量合成等关键生物过程会受到限制，导致细胞功能受损甚至细胞死
甲壳动物在受到低氧或复氧胁迫时，常通过启动体内抗氧化酶体系（CAT、SOD、GSH-PX等）等氧化损伤保护机制，使动物体内的活力氧（ROS）处于动态平衡以减轻胁迫损
ACP及AKP具有在机体中催化各种含磷化合物水解反应的生理生化功能，并直接构成了甲壳动物的内解毒体系，在甲壳动物的非特异性免疫应答中发挥着重要作
由于甲壳动物在受到低氧胁迫时组织细胞内脂质会因过氧化生成MD
罗氏沼虾仔虾收到低氧胁迫时，第12~24小时内死亡率显著上升（P<0.05）且抗氧化因子水平在鳃、肝胰腺、肌肉中显著降低（P<0.05），说明12~24 h可能是罗氏沼虾仔虾低氧胁迫应激的关键时间点；复氧胁迫阶段，罗氏沼虾仔虾鳃、肝胰腺、肌肉中的抗氧化因子水平迅速上升，但在12 h恢复至对照组水平（P>0.05），说明急性复氧胁迫会在初期对罗氏沼虾仔虾产生一定氧化损伤，但随后仔虾适应了高溶氧环境。由此可见，低氧及低氧-复氧胁迫都会影响对罗氏沼虾仔虾存活及抗氧化能力造成影响。研究结果将为揭示罗氏沼虾低氧及低氧-复氧胁迫下的生理生化响应机制提供基础理论参考。
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