水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹生长、蜕壳、钙沉积和水质指标的影响

黄俊杰，朱筛成，马天利，蒋栋梁，成永旭; HUANG Junjie; ZHU Shaicheng; MA Tianli; JIANG Dongliang; CHENG Yongxu

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水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹生长、蜕壳、钙沉积和水质指标的影响 PDF

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黄俊杰 ^1,2,3
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朱筛成 ^1,2,3
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马天利 ^1,2,3
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蒋栋梁 ⁴
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成永旭 ^1,2,3
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1. 上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306； 2. 上海海洋大学农业农村部稻渔综合种养生态重点实验室，上海 201306； 3. 上海海洋大学农业农村部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306； 4. 河南金丹乳酸科技股份有限公司，河南郸城 477150

中图分类号： S 966.16

最近更新：2024-09-04

DOI： 10.12024/jsou.20231104347

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摘要

为研究水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹生长、蜕壳及体内钙沉积的影响，本研究分别在淡水中添加0、218、436和654 mg/L的乳酸钙，使水体中含有45.6、84.4、123.2和163.6 mg/L的钙离子（分别记为1# ~ 4#组），对初始体质量为（4.78±0.51） g的中华绒螯蟹雌性幼蟹进行为期90 d（经历2个完整蜕壳周期）的养殖实验。结果表明：（1）随着水体乳酸钙浓度的增加，幼蟹的成活率显著上升；（2）随水体乳酸钙含量增加，第一次蜕壳后体质量、体质量增长率、特定生长率和肝胰腺指数均呈上升趋势，但差异不显著；而第二次蜕壳后幼蟹体质量、壳长和壳宽增长率均随着水体乳酸钙添加显著升高，其中3#组和4#组显著高于1#组；（3）添加乳酸钙对蜕壳间隔无显著差异，但可显著降低幼蟹的残肢率；（4）在钙沉积方面，添加乳酸钙可以显著提高幼蟹第一次蜕壳和第二次蜕壳阶段中血淋巴钙含量以及第一次蜕壳阶段幼蟹肌肉中的钙含量；（5）乳酸钙含量的增加可显著提高es EcR2和es RXR基因的表达丰度；（6）添加乳酸钙对水体pH、氨氮和亚硝酸盐无显著影响，而硬度和碱度随着乳酸钙含量增加而显著上升。综上，水体添加654 mg/L乳酸钙可提高幼蟹成活率、生长性能、组织中钙沉积和蜕壳相关基因表达丰度，并能降低幼蟹蜕壳后的残肢率。

关键词

中华绒螯蟹; 乳酸钙; 生长性能; 蜕壳; 钙沉积

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis），俗称河蟹，因其营养丰富和独特的口味深受消费者喜爱，随着消费需求的不断上升和繁育养殖技术的进步，中华绒螯蟹已成为我国水产养殖业重要的养殖对象之一^［

1-2］。2022年我国中华绒螯蟹的年产量达到81.5万t，产值超过500亿元^{［参考文献 3

百度学术}3］。蜕壳是中华绒螯蟹生长过程中的一种重要的生理现象，从蚤状幼体生长到成蟹需要经历约19次蜕壳^{［参考文献 4

百度学术}4］，但刚完成蜕壳时是其最脆弱的阶段，因其外骨骼尚未硬化，无法抵御细菌威胁和其他生物蚕食，这是导致其存活率低的主要原因之一^{［参考文献 5

百度学术}5］。此外，脱壳不顺利也常导致中华绒螯蟹附肢脱落。有研究表明，断肢的中华绒螯蟹在后续的防御、捕获、进食能力和免疫力方面大大降低^{［参考文献 6-7}6-7］，且需要消耗更多的能量用于断肢的重生而非用于生长^{［参考文献 7

百度学术}7］。所以，良好的蜕壳状态对其后续体质量的增加和健康状况都起着显著的影响^{［参考文献 8

百度学术}8］。因此，提高中华绒螯蟹蜕壳成功率对提高中华绒螯蟹产量和经济效益具有重要的意义。

钙离子是虾蟹外壳硬化过程中的关键离子^［

9］，在蜕壳过程中，甲壳动物会失去体内大约95%的钙^{［参考文献 10

百度学术}10］，在蜕壳后期，甲壳动物便进入快速矿化期，在此阶段，甲壳动物一方面需要调动脱壳前储存在肝胰腺和血液中的钙使其沉积在新形成的表皮中^{［参考文献 11-12}11-12］，另一方面从水环境中直接吸收钙离子以加速新壳的硬化^{［参考文献 13

百度学术}13］。因此，在水体中补充钙离子是非常重要的环节。在中华绒螯蟹养殖过程中，许多养殖户在中华绒螯蟹蜕壳前后定期向水体泼洒含钙制剂。然而目前含钙制剂种类繁多，且泼洒钙的量也主要凭经验，并无系统的研究报道。鉴于此，本研究以乳酸钙作为主要钙源，通过向水体中添加不同浓度的乳酸钙，研究其对中华绒螯蟹幼蟹生长、存活、蜕壳、组织中钙沉积以及对水质的影响，旨在探究中华绒螯蟹幼蟹阶段水体中适宜的乳酸钙泼洒量，以期为今后含钙制剂的使用和中华绒螯蟹养殖技术提高提供理论依据和实际参考。

1 材料与方法

1.1 实验用蟹及实验设计

实验用幼蟹于2023年3月取自上海海洋大学崇明基地幼蟹养殖池塘，从中挑选144只四肢健全且活力较好，处于蜕壳间期，初始体质量为4~6 g的幼蟹用于养殖实验。为了避免不同性别的差异，因此本实验只采用雌蟹进行正式实验。

本实验共设置4个钙离子组，实验初分别向养殖水体中添加0、218、436和654 mg/L的乳酸钙（河南金丹乳酸科技股份有限公司），使得水体最终钙离子含量为45.6、84.4、123.2和163.6 mg/L，分别记为1#、2#、3#和4#组，具体添加量和实测值如表1所示。每个钙离子组设置3个重复，每个重复组有12只幼蟹。

表1 实验浓度设计

Tab.1 Experimental concentration design

组别 Group	添加物 Additive	理论添加Ca²⁺浓度 Theoretical Ca^{2 +} concentration/(mg/L)	水体实际Ca²⁺浓度 Actual Ca^{2 +} concentration in water/(mg/L)
1#组 Group 1#	无	0	45.6
2#组 Group 2#	乳酸钙	40	84.4
3#组 Group 3#	乳酸钙	80	123.2
4#组 Group 4#	乳酸钙	120	163.6

养殖实验在室内12个循环聚氯乙烯（PVC）水槽（长×宽×高=2.9 m×0.8 m×0.3 m）中进行，在每个水槽中放置12个四周和底部有小孔的单养盒子（长×宽×高=32 cm×21 cm×17.5 cm，水深12 cm），共144个盒子，将144只蟹随机放入盒中单独养殖，在盒底放置瓦片作为隐蔽物。所有实验幼蟹在养殖盒暂养直至完成蜕壳，并待其3 d后新壳变硬后开始正式实验，并记录此时幼蟹的体质量以及蜕壳日期。待90%幼蟹完成第3次蜕壳（即2个完整的蜕壳周期）即停止实验。

1.2 养殖管理

在整个养殖过程中，每日18：00左右投喂商业饲料（浙江澳华饲料有限公司幼蟹料，钙含量≈1.51%），投喂为中华绒螯蟹总体质量的1.5%~3.0%，根据水温和摄食等情况灵活调整投喂量，投喂后3 h约21：00左右观察摄食情况，并于次日上午9：00左右吸走残饵和粪便，同时检查幼蟹蜕壳和死亡情况，做好相关记录。养殖期间，24 h充氧，采用40 W日光灯作为光源（12 h光照 + 12 h黑暗），每天上午用温度计测定养殖用水温度，每周测定一次水质（亚硝酸盐、氨氮、pH），水质指标：pH 7.0~9.0；溶氧 > 4 mg/L；氨氮 < 0.5 mg/L；亚硝酸盐 < 0.15 mg/L。实验期间24 h不间断增氧，实际亚硝态氮和氨氮含量均低于0.05 mg/L，溶氧高于9 mg/L。

图1 实验期间养殖水体温度日变化情况

Fig.1 Diurnal variation of aquaculture water temperature during the experiment

1.3 样品和数据的采集

1.3.1 水样的采集与测定

每隔7 d使用哈希便携式水质分析仪（HQ30d， HACH，）检测水体的pH和溶氧，使用水质测试盒（北京桑普水博士有限公司）检测水体的氨氮和亚硝态氮含量；每隔15 d从实验水槽中取50 mL水样进行硬度和碱度的测定，总硬度和总碱度的测定参照国家标准（GB 7477—87和GB 12763.4—91）。

1.3.2 样品和数据的采集

实验期间，每天观察实验蟹蜕壳情况，并记录每次蜕壳蟹的编号、蜕壳日期和幼蟹蜕壳后附肢残缺情况，用于计算蜕壳后的存活率（Survival rate， SR）、蜕壳率（Molt rate， MR）、蜕壳间隔（Intermolt duration， ID）和残肢率（Limb loss rate， LLR）。当幼蟹每次完成蜕壳后3 d，待其甲壳变硬，将其体表水分擦干后用电子天平（精准度=0.01 g）测量体质量，用游标卡尺测量壳长和壳宽，据此计算各组中华绒螯蟹的体质量增长率（Weight gain rate， WGR）、特定生长率（Specific growth rate， SGR）、壳长增长率（Carapace length growth rate， CLGR）和壳宽增长率（Carapace width growth rate， CWGR）。每次蜕壳后，每个重复组分别采样3只（即每个乳酸钙组采样9只）蜕壳后3 d的蟹，将幼蟹放在冰上麻醉后，用1 mL的无菌注射器从实验蟹的第三步足基部抽取1 mL血淋巴装入1.5 mL离心管中于-40 ℃保存。随后沿蟹壳侧面将蟹壳与躯体分离，迅速解剖取出中华绒螯蟹Y器官经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中用于后续总RNA提取。随后解剖取出肝胰腺并用电子天平准确称重用于计算肝胰腺指数（Hepatosomatic index， HSI）。再用剪刀和镊子刮取肌肉，将肝胰腺、肌肉和蟹壳分别装入自封袋中于-40 ℃保存用于组织中钙含量测定。各组幼蟹的成活率（SR）、体质量增长率（WGR）、特定生长率（SGR）、壳长增长率（CLGR）、壳宽增长率（CWGR）、蜕皮间隔（ID）、蜕壳率（MR）、残肢率（LLR）和肝胰腺指数（HSI）计算公式：

S_R= N₂/N₁×100%

（1）

W_GR=（M₂ - M₁）/M₁×100%

（2）

S_GR=100%×（ln M₂ - ln M₁）/T

（3）

C_LGR=100%×（L₂ - L₁）/L₁

（4）

C_WGR=100%×（W₂ - W₁）/W₁

（5）

M_R=N₃/N_l×100%

（6）

I_D=D_n - D_n_-1

（7）

L_LR=100%×N₄/N_l

（8）

H_SI=M_H/M₂×100%

（9）

式中：S_R 为存活率，%；N₁为各组幼蟹初始数量，只；N₂为实验结束时各组幼蟹成活数量和已经采样蟹数量之和，只；W_GR为体质量增长率，%；M₂为蜕壳硬化3 d后蟹的体质量，g；M₁为蜕壳前蟹记录体质量，g；S_GR 为特定生长率，%/d；C_LGR为壳长增长率，%；L₁为蜕壳前蟹记录壳长，cm；L₂为蜕壳硬化3 d后蟹壳长，cm；C_WGR为壳宽增长率，%；W₁为蜕壳前蟹记录壳宽，cm；W₂为蜕壳硬化3 d后蟹壳宽，cm；I_D为蜕壳间隔，d；D_n为第n次完成蜕壳时间，d；D_n_-1为第n-1次完成蜕壳时间，d；M_R 为蜕壳率，%；N₃为完成蜕壳蟹数量；L_LR 为残肢率，%；N₄为蜕壳后附肢残缺蟹数量，只；H_SI 为肝胰腺指数；M_H为肝胰腺质量，g。

1.3.3 甲壳、肝胰腺、肌肉以及血液中钙沉积的测定

使用IKA微型匀浆器（德国IKA公司）将解冻后的血淋巴样品匀浆，随后将匀浆液离心（12 000 r/min，4 ℃， 20 min），收集上清液，采用电解质分析仪（K-Lite 5，广东梅州康立高科有限公司生产）测定血清钙离子含量。肌肉、肝胰腺和蟹壳经冷冻干燥后粉碎，随后将其交予上海疾控中心使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定各组织中钙含量。

1.3.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

由于幼蟹Y器官样品量较少，为了满足分析测试需求，每个重复组随机取3只蟹Y器官合并一个样品，即每个乳酸钙组最终有3个样本。用Trizol提取Y器官的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法分别检测RNA的完整度和纯度。各取100 ng总RNA为反转录模板，采用反转录试剂盒（Cat. AG11705，湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行cDNA合成，并保存在-20 ℃用于qRT-PCR分析。

实验中以β-actin作为qRT-PCR的内参基因，中华绒螯蟹蜕壳相关基因EcR和RXR的引物分别参考潘杰等^［

14］和王瑶等^{［参考文献 15

百度学术}15］，实验用引物均委托上海生工生物工程有限公司合成（表2）。根据qRT-PCR试剂盒（Cat. AG11746）说明书，将模板cDNA梯度稀释后进行标准曲线扩增。当无非特异性扩增，目标基因和内参基因的扩增效率在95%~105%。反应体系： 2×SYBR Green pro Taq HS Premix Ⅳ 10 μL，cDNA（10 ng/μL） 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH₂O 7.8 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。采用Bio-Rad荧光定量PCR分析仪（CFX-384，Bio-Rad，The United States of America）测定肝胰腺样品中各基因的表达量。每个样品均重复3次，采用2^-ΔΔ^C_t法对蜕壳相关基因的相对表达量进行分析。

表2 荧光定量PCR的引物序列

Tab.2 Primers for qRT-PCR determination of the studied genes

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence	参考文献 Reference
Es EcR2-F	CCCATTAGTCCATGTAAATCCA	潘杰等^{[参考文献 14 百度学术}14]
Es EcR2-R	GCATGGCTGACATAGGAGAC	潘杰等^{[参考文献 14 百度学术}14]
Es RXR-F	CCTCCGCTCCATCGTCCTAT	王瑶等^{[参考文献 15 百度学术}15]
Es RXR-R	GGTGCGTGTGTACTCCTCCA	王瑶等^{[参考文献 15 百度学术}15]
β-actin-F	ACCTCGGTTCTATTTTGTCGG	潘杰等^{[参考文献 14 百度学术}14]
β-actin-R	ATGCTTTCGCAGTAGTTCGTC	潘杰等^{[参考文献 14 百度学术}14]

1.4 数据分析

使用SPSS 19.0软件进行统计分析。数据表示为平均值±标准差，用Levene法进行方差齐性检验，当数据不满足齐性方差时，对百分比数据进行反正弦或者平方根处理，随后采用One way-ANOVA对实验结果进行方差分析，采用Tukey's-b（K）法进行多重比较；若数据转换后仍不满足齐性方差时，采用Games-Howell非参数检验进行多重比较，取P < 0.05为差异显著。在Graphpad软件上绘制相关图表。

2 结果

2.1 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹成活的影响

由图2可知，各组幼蟹在前30 d时成活率均为100%，从第40 天开始，整体上各组幼蟹成活率均出现下降趋势，且各组成活率出现显著差异（P ＜0.05）。其中在40~50 d时，2#组和4#组幼蟹成活率显著高于1#组（对照组），而从60 d至实验结束时，随着水体乳酸钙添加量增加，幼蟹成活率显著增加，在4#组的幼蟹存活率最高（75%）显著高于对照组（58.33%，P < 0.05）。

图2 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹成活的影响

Fig.2 Effect of adding calcium lactate to water on the survival of juvenile E.sinensis

同列不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

Different lowercase letters in the same column indicate significant differences （P <0.05）.

2.2 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹生长的影响

水体中添加不同浓度乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹生长性能的影响见图3~5。在第一次蜕壳完整蜕壳阶段，各组幼蟹蜕壳后的终末体质量、体质量增长率、特定生长率、壳长和壳宽增长率以及肝胰腺指数均随着乳酸钙添加呈现轻微上升的趋势，但是差异不显著（P ＞0.05）。第二次完整蜕壳阶段，随着水体乳酸钙添加，幼蟹蜕壳后的终末体质量、壳长和壳宽增长率显著升高（P ＜0.05），其中3#组和4#组显著高于1#组（P ＜0.05）。就2个完整蜕壳周期（整个实验周期）而言，各组幼蟹最终的体质量增长率和壳长增长率随着水体乳酸钙添加量增加而显著升高（P ＜0.05），且最高值均在3#组。

图3 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹第一次蜕壳周期幼蟹生长性能的影响

Fig.3 Effects of adding calcium lactate to water on the growth performance of the first molting juvenile E.sinensis

图4 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹第二次蜕壳周期幼蟹生长性能的影响

Fig.4 Effects of adding calcium lactate to water on the growth performance of the second molting juvenile E.sinensis

方柱上不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

Different lowercase letters in the columns indicate significant differences （P <0.05）.

图5 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹两次完整蜕壳周期幼蟹生长性能的影响

Fig.5 Effects of adding calcium lactate to water on the growth performance of the two whole molting stages juvenile E.sinensis

方柱上不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

Different lowercase letters in the columns indicate significant differences （P <0.05）.

2.3 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹蜕壳的影响

由图6可知，在幼蟹在第一次蜕壳阶段的蜕壳间隔为27~54 d，在第二次蜕壳阶段的蜕壳间隔为25~52 d，但是乳酸钙的添加对幼蟹第一次蜕壳阶段、第二次蜕壳阶段以及2次蜕壳的总蜕皮间隔均无显著影响（P ＞0.05）。

图6 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹蜕壳间隔的影响

Fig.6 Effects of adding calcium lactate to water on intermolt duration of juvenile E.sinensis

由图7可知，随着水体乳酸钙添加，幼蟹在第一次蜕壳阶段和第二次蜕壳阶段的残肢率均显著降低（P ＜0.05）。其中在第一次蜕壳阶段，添加乳酸钙组（2#、3#和4#组）的幼蟹残肢率显著低于1#组和2#组，且4#组幼蟹残肢率为0%。在第二次蜕壳阶段，3#和4#组幼蟹蜕壳后的残肢率也均为0%，显著低于1#组和2#组，但1#组和2#组之间没有显著差异。

图7 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹残肢率影响

Fig.7 Effects of adding calcium lactate to water on limb loss rate of juvenile E.sinensis

方柱上不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

Different lowercase letters indicate significant difference （P <0.05）.

2.4 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹组织中钙沉积的影响

水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹血淋巴、肌肉、肝胰腺和头胸甲中钙沉积影响如图8所示。就血淋巴而言（图8a和图8b），在第一次蜕壳和第二次蜕壳阶段幼蟹血淋巴中钙离子含量均随着水体乳酸钙含量添加而显著增加，且4#组显著高于1#组（P ＜0.05）。就肌肉而言（图8c和图8d），在第一次蜕壳时幼蟹肌肉中钙含量显著上升，且4#组显著高于其他组（P ＜0.05），而在第二次蜕壳时各组无显著差异（P ＞0.05）。就肝胰腺而言（图8e和图8f），各组幼蟹在第一次蜕壳和第二次蜕壳阶段，其肝胰腺中钙含量均无显著差异（P＞0.05）。就头胸甲而言（图8g和图8h），在第一次蜕壳阶段，各组幼蟹头胸甲中的钙含量随乳酸钙含量增加呈现明显上升趋势，在第二次蜕壳阶段各组幼蟹头胸甲中的钙含量无显著差异（P ＞0.05）。

图8 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹组织中钙沉积的影响

Fig.8 Effects of adding calcium lactate to water on calcium deposition in juvenile E.sinensis

方柱上不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

Different lowercase letters indicate significant difference （P <0.05）.

2.5 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹蜕壳相关基因表达的影响

荧光定量结果显示，水体中添加乳酸钙对幼蟹Y器官中es EcR2和 es RXR基因表达均有显著促进作用（图9a和图9b）。就es EcR2基因而言，4#组幼蟹Y器官中es EcR2表达量显著高于1#组（P <0.05），而其余各组无显著差异；就es RXR基因而言，3#组和4#组幼蟹Y器官中es RXR表达量显著高于对照组（P <0.05）。

图9 水体中添加乳酸钙对中华绒螯蟹幼蟹蜕壳相关基因表达丰度的影响

Fig.9 Effects of adding calcium lactate to water on the expression of molting related genes in juvenile E.sinensis

方柱上不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

Different lowercase letters indicate significant difference （P <0.05）.

2.6 水体中添加乳酸钙对水质影响

由图10可知，添加不同含量乳酸钙对水体中pH变化无显著影响，均在8.1~8.8，且均在合适中华绒螯蟹养殖的pH范围之内。而水体中添加乳酸钙显著增加了水体的硬度和碱度，水体硬度由144 mg/L上升至384 mg/L（图10b），碱度由183 mg/L上升至588 mg/L（图10c）。

图10 水体中添加乳酸钙对水体pH、硬度和碱度的影响

Fig.10 Effects of adding calcium lactate on pH， hardness and alkalinity in cultural water

3 讨论

3.1 水体中添加乳酸钙对幼蟹成活的影响

钙是水生动物生命活动中必需的元素，是构成骨、齿、鳞及甲壳的主要成分，在组织中参与肌肉收缩、血液凝固、神经传导、渗透压调节、某些酶的激活以及细胞膜的完整性和通透性的维持等生理作用^［

16-17］。因此，钙的摄入对机体健康有至关重要的作用^{［参考文献 18

百度学术}18］。在本研究中，我们发现在养殖开始30 d前均未发生死亡，从30~80 d时开始死亡数量开始增加，这可能是30~80 d时中华绒螯蟹陆续经历了2次蜕壳引起的。有研究表明，甲壳动物大部分死亡发生在蜕皮期间以及蜕皮后一周内，由于无法完成蜕壳或是无法完成新壳的硬化而死亡^{［参考文献 19

百度学术}19］。而随着乳酸钙浓度的升高，中华绒螯蟹存活率也逐级上升，说明乳酸钙能够提高中华绒螯蟹蜕壳和硬化成功率，从而提高了中华绒螯蟹的成活率。这与之前对水蚤（Daphnia）^{［参考文献 20

百度学术}20］、库氏矛螯虾（Paranephrops zealandicus）^{［参考文献 21

百度学术}21］、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）^{［参考文献 19

百度学术}19］的研究结果一致，表明了钙的添加对甲壳动物的存活率具有正向影响。

3.2 水体中添加乳酸钙对幼蟹生长和蜕壳的影响

中华绒螯蟹的生长伴随着蜕壳现象的发生而实现，由于蜕壳过程中中华绒螯蟹会丢失大量的矿物质^［

22］，因此，外源钙的补充对中华绒螯蟹的生长具有重要的作用。本研究发现在第一次蜕壳阶段，幼蟹蜕壳后的体质量、体质量增长率（WGR）和特定生长率（SGR）随乳酸钙添加呈上升趋势，但差异不显著。至第二次蜕壳阶段，幼蟹的蜕壳后体质量、WGR和SGR随乳酸钙增加而显著上升。这表明乳酸钙添加对中华绒螯蟹的生长有明显促进作用，且随着钙离子处理时间越长，促进效果越显著。这可能是随着乳酸钙添加使得水体渗透压逐渐上升，更接近中华绒螯蟹体内的渗透压，从而降低了中华绒螯蟹渗透调节的能量消耗，这意味着更多的营养物质可用于幼蟹的生长发育^{［参考文献 23

百度学术}23］。在日本沼虾（Macrobrachium mipponensis）^{［参考文献 24

百度学术}24］和凡纳滨对虾^{［参考文献 19

百度学术}19］中也发现类似的结果。

蜕壳过程对中华绒螯蟹幼蟹的生长起着至关重要的作用。然而蜕壳是一个非常耗能的过程，需要积累足够多的能量才能完成一次良好的蜕壳^［

25］。本研究结果表明，添加乳酸钙后，无论是第一次蜕壳还是第二次蜕壳，添加乳酸钙组中华绒螯蟹的残肢率均显著优于淡水组，尤其是乳酸钙添加量在436 mg/L及以上后基本无蜕壳残肢现象。这表明乳酸钙对中华绒螯蟹蜕壳及附肢完整性具有显著的正向作用。而肢体再生是一个能量投入的过程，需要消耗大量自身营养物质^{［参考文献 7

百度学术}7］，这也是乳酸钙添加组中华绒螯蟹生长性能好于对照组的原因之一。且有研究表明，肢体残缺后更容易受到病菌感染，食欲下降，最终导致高死亡率^{［参考文献 26

百度学术}26］，正与本实验中对照组的死亡率显著高于乳酸钙添加组的研究结果一致。

中华绒螯蟹蜕壳主要受到Y器官分泌的蜕皮激素影响^［

27］，而在甲壳动物中蜕皮激素主要依靠于蜕皮激素受体（Ecdysone receptor， EcR）和维甲类 X 受体（Retinoid X receptor， RXR）组成复合体后进一步指导调控下游E74 和 E75 等基因的转录，从而调节甲壳动物的生长和蜕壳过程^{［参考文献 28

百度学术}28］。本实验通过采集中华绒螯蟹幼蟹Y器官进行荧光定量验证，水体中添加乳酸钙对幼蟹Y器官中es EcR2和 es RXR基因表达均有显著促进作用。因此，水体中添加乳酸钙可以通过上调EcR和RXR基因表达来提高中华绒螯蟹幼蟹的蜕壳成功率。

3.3 水体中添加乳酸钙对幼蟹组织中钙沉积的影响

外骨骼的快速矿化是甲壳动物蜕壳过程中重要的生理现象，主要发生在蜕皮后期阶段，此阶段体内各组织中的矿物质含量会进行重构^［

22，29］。有报道认为，甲壳动物外骨骼中的钙会从壳中溶解并通过外表皮进入到血淋巴中，大部分转移到组织和器官等进行临时储存以便后来沉积到新形成的外骨骼中^{［参考文献 30

百度学术}30］。血淋巴是中华绒螯蟹体内钙离子转运的主要运输介质，因此，其含量的变化是中华绒螯蟹体内钙沉积和转运的重要指标。在本实验中，我们通过向水中添加乳酸钙来单独改变水中的钙离子浓度。结果表明，中华绒螯蟹的血液中的钙离子含量随着乳酸钙添加量的增加而显著上升，特别是在654 mg/L乳酸钙组，其血液中的钙离子浓度显著高于淡水组。前期对中华绒螯蟹的研究中发现，随着水体盐度和钙离子含量的升高，中华绒螯蟹机体会增加对水中钙离子的吸收^{［参考文献 31

百度学术}31］。这些结果都表明外界钙离子的添加可以显著提高中华绒螯蟹血液中钙离子的浓度。但是也有一些其他物种不同，如凡纳滨对虾^{［参考文献 32

百度学术}32］和罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）^{［参考文献 33

百度学术}33］，它们血液钙含量不会随着外界盐度和钙离子含量的改变而改变，这可能是因为不同物种之间钙离子调节机制上存在差异，导致它们对环境条件的响应不同。

肝胰腺是甲壳动物负责代谢和储存的器官，为了形成新的甲壳，将会消耗大量肝胰腺中所储存的钙^［

10］，从而使肝胰腺中钙含量急剧减少。本实验中，第一次和第二次蜕壳后肝胰腺钙含量均差异不大且含量极少，仅为2 mg/g左右，这可能是本研究采样时中华绒螯蟹处于蜕皮间期的早期阶段，此时肝胰腺中储存的钙离子刚被转移至外骨骼中沉积。戚常乐等^{［参考文献 34

百度学术}34］研究也发现，蜕壳后期和蜕壳前期相比，肝胰腺中钙离子含量极显著降低，由8 mg/g降低至2 mg/g，与本研究的结果类似。徐宾朋等^{［参考文献 35

百度学术}35］也在对拟穴青蟹（Scylla paramamosain）的研究中发现，在拟穴青蟹蜕壳后期B期肝胰腺钙含量仅为5.65 mg/g，和蜕壳期峰值差十倍左右。表明在蜕壳后期，中华绒螯蟹肝胰腺中钙流向了甲壳形成新的体壁后再开始吸收环境中的钙，形成一个新的平衡。

同样地，在本实验中，第一次蜕壳后肌肉钙含量随着乳酸钙含量增加而显著上升，特别是654 mg/L乳酸钙组显著高于淡水组，但是第二次蜕壳后肌肉钙含量则没有差异，可能是第一次蜕壳时幼蟹体质量较小，外骨骼矿化所需钙的量较少，而第二次蜕壳后体质量增大，外骨骼矿化所需钙含量较前一次蜕壳高，体内的存储的钙离子主要用于外骨骼的矿化，从而导致各组肌肉中沉积的钙含量区别不大。

甲壳动物外骨骼主要成分有几丁质、碳酸钙以及蛋白质，还有一些微量复合物构成^［

35］，是维持体型、防御威胁和进行机体运动的必需条件，因此，一个足够坚硬的外骨骼可以很好的协助甲壳动物生长发育。在本实验中发现随着乳酸钙的添加，甲壳中钙含量呈现上升趋势。这说明乳酸钙的添加对中华绒螯蟹甲壳的矿化具有促进作用。这一发现和PERRY等^{［参考文献 36

百度学术}36］在对蓝蟹（Callinectes sapidus）的研究结果相符，蓝蟹在正常钙浓度范围内甲壳钙沉积随着钙浓度的增加梯度上升。

3.4 水体中添加乳酸钙对水体的水质影响

硬度和碱度是水产养殖水化学的重要指标。养殖水体中硬度高有利于池塘肥水，稳定pH，稳定池塘状态，有利于甲壳动物生长。而在甲壳动物中，若是水体硬度过低，则会引发虾蟹类动物骨骼发育不良，壳软，且在蜕壳阶段病菌更容易侵入虾蟹体内造成存活率下降，生长不良等影响^［

37］。本实验中，添加乳酸钙能梯度增加水体硬度，有利于中华绒螯蟹生长发育。研究表明，水体碱度对水体中生物生长发育有显著影响，一般水体碱度过小，水生生物发育会变缓，而碱度过高则会对生物生存产生影响^{［参考文献 38

百度学术}38］，已有研究^{［参考文献 39

百度学术}39］发现，当甲壳动物处于碱度偏高的环境中时，体内不同指标都会呈现应激状态，如SOD、CAT、GSH等活性均显著下降，机体遭受氧化损伤，免疫力下降，严重影响存活。而杨雨虹等^{［参考文献 40

百度学术}40］对中华绒螯蟹幼蟹碱度胁迫研究发现，中华绒螯蟹碱度生存的安全浓度是1 825 mg/L，本实验添加后水体碱度最高仅为520 mg/L，因此，添加乳酸钙增加碱度不会影响中华绒螯蟹的生长发育。

综上所述，在水体中添加654 mg/L乳酸钙（4#组）能显著提高幼蟹的成活率、体质量增长率、壳长和壳宽增长率以及血淋巴和肌肉中钙含量，此外可显著提高与蜕壳相关基因表达量并显著降低蜕壳后残肢率。

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