摘要
为了揭示嗜水气单胞菌的耐药潜力，运用微量肉汤稀释法和比较基因组学方法对其进行了分析。结果显示：恩诺沙星、硫酸新霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素对3株菌株有抑制作用，而磺胺间甲氧嘧啶对3株菌株均无抑制作用。菌株的耐药表型未与耐药基因一一对应，某些菌株虽然未注释到耐药基因，也可以表现出相关耐药表型；自测的3株菌株基因组大小差异较大，亲缘关系非近缘，但耐药基因数量基本一致；经ANI（平均核苷酸一致性）计算后，基因组比较分析发现嗜水气单胞菌基因组具有较强的可变性，即使是近缘菌株，其基因组间仍有较大差异；系统发育分析显示，不同宿主来源的菌株在进化树上呈现分散分布，近缘菌株分布在不同国家和地区；所有菌株在CARD（综合抗生素耐药性数据库）中共注释到21种耐药基因，其中7种耐药基因为所有菌株共享。造成这一现象的原因，很可能是由于嗜水气单胞菌基因组较强的可变性以及其宿主分布的广泛性，菌株间进行频繁的基因交流，促进了耐药基因在整个物种的快速扩散，所以即使菌株间基因组变化较大，但耐药基因在菌株间的变化较小。
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为革兰氏阴性杆菌，其分布广泛，是人-兽-鱼共患的条件致病
植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）在不同生境中表现出适应性进
本研究首先对3株嗜水气单胞菌进行药敏试验，这3株菌分离自发病的鱼类，前期已经过16S rDNA和gyrB测序将其鉴定到种水平；然后对其进行全基因组测序，并将下载自NCBI（National Center for Biotechnology Information Search database， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的118株菌株基因组进行重新注释，以探究耐药基因在基因组中的分布规律，从而在表型和基因组两个层面证实该菌的耐药潜力，为水产业和临床对该菌的防治提供参考依据。
数据集包括3株新测序的嗜水气单胞菌基因组序列，以及118株NCBI数据库已公布的基因组序列。新测序菌株背景信息：菌株104、117分离自江苏省南京市，宿主为鲫（Carassius auratus）；菌株A058分离自福建省厦门市，宿主为乌鳢（Channa argus）。公共序列背景信息： NCBI数据库中具有宿主和地理来源信息的基因组序列。
取保藏的菌液纯培养（30 ℃培养24 h），参照《药敏分析试剂板》说明书进行操作，观察并记录菌株的最小抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），取3组实验平行。实验结果依据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）推荐的分界点值判断敏感、中介或耐药。药敏板购自南京菲恩医疗科技公司。
提取的DNA样品基于Illumina Hiseq测序平台，文库片段为350 bp左右，进行双末端PE150测序，平均测序深度为212×。
使用Trimmomatic v0.36软件过滤尾端低质量序列（Q<20
为了确定所获得基因组是否为嗜水气单胞菌，使用 FastANI v1.32分析所有基因组两两之间的ANI（Average nucleotide identity
使用OrthoFinder软件，基于马尔可夫聚类算法（Markov Cluster Algorithm，MCL）进行聚类并检测基因组两两之间共享的蛋白家
使用PhyloPhlAn3.0构建串联蛋白系统发育
使用BLASTp模式，将菌株基因组预测的蛋白序列比对到CAR
5种抗菌药物对3株自测菌株的MIC见
药物 Drug | 104 | 117 | A058 |
|---|---|---|---|
|
恩诺沙星 Enrofloxacin | 0.125 | 0.5 | 4 |
|
硫酸新霉素 Neomycin sulfate | 0.5 | 8 | 1 |
|
氟苯尼考 Florfenicol | 0.5 | 4 | 8 |
|
盐酸多西环素 Doxycycline hydrochloride | 16 | 4 | 2 |
|
磺胺间甲氧嘧啶 Sulfamethoxypyrimidine | 512 | 1 024 | 1 024 |
3株菌株GC%介于61.41%~61.49%之间，与数据库中其他该菌基因组GC%基本一致，3株菌基因组大小和编码基因数量相差较大，但注释到的耐药基因数量比较接近，菌株104、117、A058分别预测到了 67、62、68个耐药基因，见
| Sample ID样品ID | G+C/% | Gene_num 基因数量 | All_len 全长 | Max_len 最大长度 | Contig_num 重叠群数量 | N50 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 104 | 61.42 | 4 836 | 4 997 127 | 54 548 | 1 378 | 6 262 |
| 117 | 61.41 | 4 355 | 4 725 678 | 458 152 | 77 | 175 450 |
| A058 | 61.49 | 4 524 | 4 849 717 | 808 401 | 38 | 459 219 |
经ANI计算，数据集共收集到115株嗜水气单胞菌基因
基因组的比较分析揭示了嗜水气单胞菌基因组的多样性（
图1 自测嗜水气单胞菌与数据库参考基因组的比较分析
Fig.1 Comparative analysis of self-sequenced A. hydrophila and database reference genomes
对整个物种的泛基因组分析显示（
本研究基于串联蛋白构建了嗜水气单胞菌的系统发育树，除了一些很近缘的节点外，绝大多数节点的支持率高于0.7（
图2 自测嗜水气单胞菌与数据库参考基因组的进化树
Fig.2 In the evolutionary tree of self-sequenced A. hydrophila and database reference genome
灰色圆点表示节点支持率（bootstrap value）超过0.7的节点，内圈彩色条带表示宿主，外圈彩色条带表示菌株地理位置。
The gray dots represent the nodes whose bootstrap value exceeds 0.7， the inner colored bands represent the hosts， and the outer colored bands indicate the geographic locations of the strains.
嗜水气单胞菌在地域上也呈现分散分布，如同一地区分布着不同亲缘关系的菌株，而近缘菌株也可在不同的国家和地区被检测到（
中国 China | 美国America | 巴西 Brazil | 亚洲 Asia | 其他国家Others | 总计 Total |
|---|---|---|---|---|---|
| 35 | 29 | 29 | 17 | 11 | 121 |
注： 亚洲代表除中国以外的亚洲国家和地区；其他国家代表除前面提到的国家和地区的其他国家。
Notes： Asia stands for Asian countries and regions other than China； Others stands for other countries in addition to the countries and regions mentioned above.
鱼源 Fish | 人源 Human | 环境Environment | 哺乳类 Mammals | 爬行类源Reptiles | 总计 Total |
|---|---|---|---|---|---|
| 66 | 29 | 21 | 3 | 2 | 121 |
注： 哺乳类代表除人类以外的哺乳类。
Notes： Mammals represent mammals other than humans.
在嗜水气单胞菌中共检测到了21种耐药基因，其中7种为所有菌株共享（包括抗碳青霉烯类、头孢菌素类、二氨基嘧啶类、氟喹诺酮类、青霉烷类、氯霉素类、四环素类药物的耐药基因），此外，埃尔福霉素的耐药基因也在很多菌株中被发现。在3株自测的菌株中，除共有的耐药基因外，菌株104中还检测到了抗埃尔福霉素和抗大环内酯类药物的耐药基因，菌株A058中检测到了抗埃尔福霉素和抗氨基糖苷类药物的耐药基因。与菌株104亲缘最近的为GCA_000708065.1，其中未检测到非共有基因，而在与菌株117和A058亲缘最近的GCA_003014775.1、GCA_020639395.1中，检测到了抗埃尔福霉素的耐药基因。以菌株的分离来源统计，携带耐药基因数量较多的几个基因组宿主全部为非鱼源菌株，而菌株的地理来源主要集中在中国和美国。总体上看，除了少数几个基因组检测到的耐药基因种类较多（例如：GCA_001982465.1、GCA_002850695.3、GCA_902388065.1）外，其余的大部分都共享一个耐药基因集合。
图3 嗜水气单胞菌耐药基因的分布
Fig.3 The distribution of drug resistance genes of A. hydrophila
图中字母A-U表示的药物：碳青霉烯、头孢菌素、二氨基嘧啶、氟喹诺酮、青霉烷、苯丙醇、四环素、埃尔福霉素、氨基糖苷、大环内酯、磺胺、单环β内酰胺、头霉素、消毒剂和插层染料、链阳性菌素、林可胺类、恶唑烷酮、肽、短截北风菌素、吖啶染料、青霉烯；黄色矩形代表含有对应的耐药基因；红色三角形指向的为新测序的菌株。
The drugs indicated by letters A-U in the figure are： carbapenem，cephalosporin，diaminopyrimidine，fluoroquinolone，penam，phenicol，tetracycline，elfamycin，aminoglycoside，macrolide，sulfonamide，monobactam，cephamycin，disinfecting_agents_and_intercalating_dyes， streptogramin，lincosamide，oxazolidinone，peptide，pleuromutilin，acridine_dye，pene；The yellow rectangle indicates that the strain contains resistance genes. The red triangle points to the newly sequenced strains.
嗜水气单胞菌作为常见的革兰氏阴性菌，其暴发可导致水产动物大量死亡。而抗生素的应用，对嗜水气单胞菌的防治具有重要意义。目前，我国已批准的水产用抗生素有5大类共12
比较基因组揭示了嗜水气单胞菌基因组较强的可变性，经ANI计算后发现，菌株间即使彼此亲缘关系很近，各基因组也含有大量特有基因。GHATA
串联蛋白因其携带的遗传信息多，又不存在突变的干扰，能够使建树结果更加准
本研究中自测的3株及其最近缘菌株间虽然地理或宿主来源已产生较大变化，但耐药基因在菌株中的分布仍基本一致，可能是由于这3对菌株彼此分离的时间较短。对于携带较多耐药基因的菌株（如GCA_004684305.1、GCA_ 001687125.1、GCA_003491245.1）在其基因组中注释到了质粒等遗传物质，而遗传元件可以将外源耐药基因整合进菌株基因
菌株的耐药表型是多种复杂的机制共同作用的结果，本研究仅在表型和基因组层面对其进行了分析。在样本收集方面，菌株的取样也存在局限性，在地理来源方面，中国、美国、巴西来源的菌株较多，其他国家和地区的菌株较少；在宿主来源方面，鱼源菌株偏多，而其他来源菌株较少。对嗜水气单胞菌耐药性的研究，今后还需要进一步扩大数据集和合理的分类样本，从而使研究结果更加准确可靠。
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