马口鱼类(Opsariichthine)是鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)中独特而复杂的一个类群，过去被归于亚科(Danioninae)^[1]，最新的《世界鱼类》已将其独立为马口鱼亚科(Opsariichthyinae)^[2]。该类群分布于东亚至越南，为主要栖息于山涧溪流环境中的小型鱼类，在繁殖季节，雄性个体一般体色鲜艳，头部珠星发达、臀鳍条极为延长。其中的马口鱼属(Opsariichthys)和属(Zacco)最为常见，过去对这两个属的形态分类一般基于上下颌侧缘是否平直作为主要依据，马口鱼属口裂侧缘凹凸镶嵌，属为平直。基于传统的形态分类，这两个属曾有多个属和数十种的物种描述，陈宜瑜^[3]对马口鱼类的分类进行了重新整理，认为在东亚大陆分布的马口鱼属仅有马口鱼(O. bidens，GVNTHER, 1873)1个种、属仅有宽鳍(Z. platypus, TEMMINCK & SCHLEGEL，1846)和成都(Z. chengtui, KIMURA, 1934) 2个种，陈宜瑜^[1]也沿用了该观点。近年来众多的分子系统学的研究结果显示，基于传统形态分类方法鉴定的宽鳍和马口鱼均存在着显著的遗传分化和多个单系群，可能对应着多个不同的物种^[4-8], 而且这两个物种遗传谱系间为并系关系^[9]。鉴于马口鱼和宽鳍的并系关系，CHEN等^[10]结合形态和分子系统学的研究结果重新定义了属鱼类，认为属模式种宽鳍仅分布于日本本岛，而东亚大陆的宽鳍应为不同的物种，中国水系中应有2~3个宽鳍的近缘种。HUANG等^[11]提出马口鱼属和属的分类应依据身体的横条纹特征，马口鱼属为独立而清晰的横条纹，属的横条纹为小横条纹融合而成的较宽不规则斑块，该结论近年来逐渐得到接受，因此，成都已被归入马口鱼属。

BOULENGER^[12]曾根据采自浙江宁波的标本描述了马口鱼属一新种，命名为棘颊马口鱼(O. acanthogenys)，陈宜瑜^[3]将其视为宽鳍的同物异名。殷维^[13]基于线粒体和核基因的系统发育分析，并重新核对BOULENGER^[12]对棘颊马口鱼的原始形态描述，恢复棘颊马口鱼为有效种，并修订为棘颊(Z. acanthogenys，BOULENGER，1901)。WANG等^[14]基于线粒体细胞色素b基因(Cytb)对马口鱼类进行了深入的系统发育研究，认同CHEN等^[10]关于属的宽鳍仅分布于日本，东亚大陆的宽鳍应为不同的物种的观点，并识别出了中国除棘颊外的3个遗传谱系，并指出其对应着3个独立物种。朱兰等^[15]进一步根据形态和分子证据，将采自辽宁大凌河、黄河水系的样本，即WANG等^[14]研究结果中的谱系C描述为中华(Z. sinensis)。因此，根据新的分类系统，属目前仅有宽鳍(Z. platypus)、棘颊(Z. acanthogenys) 和中华(Z. sinensis)等3个定名物种。

在检视2021年6—9月采自浙江苕溪水系的属标本时，发现该水系的大部分样本与同一水系及浙江其他水系广泛分布的棘颊外形相似，但又存在着形态差异，同时与属其他已知物种和谱系的线粒体Cytb基因存在显著的遗传差异。因此，将其描述为属鱼类一新种。

1 材料与方法 1.1 标本采集与处理

共采集到浙江苕溪水系属新种标本17尾，其中10尾性成熟个体编号后取右侧部分鳃留作组织样本和7尾幼鱼标本用95%乙醇固定。取过组织样本后的标本使用中性甲醛固定液(10%)固定1周，后转入70%乙醇溶液长期保存。另外，还采集了浙江、安徽、河南和辽宁的属物种标本33尾于95%乙醇固定，与苕溪水系的酒精固定标本和组织样本一起用于分子生物学实验分析(表 1)。所有标本皆来自抄网和钓具捕获并保存于上海海洋大学鱼类标本馆(SHOU)。

1.2 形态学分析

形态测量工作由同一人从鱼体的左侧进行，工具为数显游标卡尺，数据精确到0.1 mm，使用SPSS 25.0处理数据和计算平均值。形态计数和测量标准参考陈宜瑜^[1]、朱兰等^[15]、陈义雄等^[16]。侧线上鳞的计数从背鳍起点前的侧面第1个鳞片开始，侧线下鳞为至腹鳍起点前的行数。对与新种形态最为相似的棘颊15尾甲醛固定标本进行了检视：SHOU2021060267、SHOU2021060268、SHOU2022010001~SHOU2022010003，5尾，体长72.67~95.28 mm，地模标本，浙江宁波甬江；SHOU2021011007，SHOU2021011008，2尾，体长125.69~126.04 mm，浙江杭州苕溪；SHOU2021060094~SHOU2021060096、SHOU2021060154~SHOU2021060156，6尾，体长88.70~106.23 mm，浙江丽水闽江；SHOU2021060008、SHOU2021060009，2尾，体长78.11~79.61 mm，安徽黄山新安江(钱塘江)。

1.3 分子系统发育分析 1.3.1 DNA提取和PCR扩增、测序

采用上海生工生物工程股份有限公司的动物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，详细步骤参考说明书。Cytb基因的扩增及测序引物为正向引物L₁₄₇₂₄(5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3')和反向引物H₁₅₉₁₅(5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3')^[17]。RCR反应条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；54 ℃退火45 s；72 ℃延伸60 s；35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保温。PCR产物用1%琼脂糖电泳检测样品扩增情况，送至上海生工生物工程股份有限公司完成双向测序。

1.3.2 数据分析

经双向测序后，将得到的正反向两段序列使用DNAstar的SeqMan^[18]软件进行拼接，并根据序列原始峰图进行手工校正。总共获得Cytb基因全序列44条，使用Clustal X^[19]软件对拼接好的序列进行比对。

为了解新种在马口鱼类群中的系统发育位置，首先从GenBank下载21条序列，包括属全部已知谱系和马口鱼类群的代表种类，以及新测序列共65条进行系统发育分析，样本和下载序列信息见表 1。使用MEGA 11.0^[20]计算序列变异位点数，分析序列的碱基组成，使用Kimura双参数模型^[21]计算转换颠换比和遗传距离。采用邻接法(Neighbor-joining, NJ)、贝叶斯法(Bayesian inferences, BI)和最大似然法(Maximum likelihood, ML)构建马口鱼类系统发育树。以MEGA 11. 0软件并基于K2P模型构建邻接树(NJ)，系统树分支置信度采用自引导法(Bootstrap analysis)，进行1 000次重复抽样检测。在jModeltest 2 ^[22]中基于AIC值选择最适碱基替代模型，用于最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)构建系统发育树，最适替代模型为GTR +I + G。ML树使用RaxML8. 0^[23]软件，设置1 000次自举检验来计算各分支的置信度。BI树的构建使用MrBayes 3.2.2^[24]，起始树设置为随机树，马尔科夫链的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carlo process, MCMC)设置为3条热链和1条冷链同时运行6×10⁶代，每1 000代对系统树进行抽样，最终得到6 001棵系统发育树, 初始的2 000棵视为老化样本舍弃, 剩余的样本构建一致树并计算后验概率。

2 结果

苕溪，新种 Zacco tiaoxiensis sp. nov.(图版Ⅰ), 正模标本SHOU2021011012雄，体长96.9 mm；2021年11月采自浙江省杭州市余杭区留下街道小和山(苕溪水系, 120°00'31″E，30°12'46″N)。

副模标本9尾: SHOU2021060252、SHOU2021060253、SHOU2021011001~SHOU2021011006、SHOU2021011011，体长72.51~110.53 mm；2021年6月采自浙江省杭州市余杭区径山镇(苕溪水系，119°48'52″E，30°25'33″N)，2021年8月采自浙江省杭州市余杭区留下街道小和山(苕溪水系，120°0'31″E，30°12'46″N)。

形态描述: 测量标本10尾，相关可量、可数和可比性状见表 2。背鳍ⅲ-7~8，臀鳍ⅲ-9，胸鳍ⅰ-13~14，腹鳍ⅰ-7~8。侧线鳞8/41~44/3~4；背鳍前鳞16~18；围尾柄鳞12~15。下咽齿3行，2.3.5/5.3.2。

体延长而侧扁，腹部圆，头长略大于体高。吻端稍钝圆。唇薄而光滑，无须。口端位，口裂接近眼中线下方，边缘较平直，向下倾斜。眼较大，位于头侧中上方，眼径与吻长近似相等，小于眼间距。背鳍无硬棘，位于体中部，外缘近平直。胸鳍末端尖，伸展不达腹鳍基部。腹鳍小，外缘呈弧形，成熟雄鱼可到达但不超过肛门，其起点与背鳍起点相对。臀鳍条前4根分枝鳍条延长，第2根最长，可超过尾柄末端。肛门紧靠臀鳍起点。侧线完全，在胸鳍上方向下弯曲，然后沿体侧下部逐渐向上延伸到尾柄中部末端。体侧鳞片中等大小，胸部与腹部鳞片细小，埋于皮下，不甚明显。

在繁殖季节，雄性在头部以及臀鳍会发育出发达的角质突起(追星)，尤其在吻端至眼前下方及颊部追星最发达，会融合成条状。吻端至眼前7~8个大追星形成的融合条通常断裂成两段，颊部3~5颗大追星也会融合成一条。这2个追星条的顶端由各追星形成的棘突呈强锯齿状。下颌追星不发达，呈小颗粒状，每侧数颗排成1~2行。繁殖季节过后，追星脱落，留下圆形疤痕，一段时间后会完全消失。

体色: 成鱼生活时体色鲜艳，眼上缘黑色，头背部和下颌黑灰色。体背部灰黑色带橘黄色，腹部银白色。体侧具有由橙色条纹隔开的不规则蓝绿色横条纹4~8条。背鳍分枝鳍条分为三部分：基部鳍条和鳍间膜均黑色；中部鳍条透明，鳍间膜黑色；外缘鳍条黑色，鳍间膜透明。雄鱼偶鳍通常橘黄色，雌鱼偶鳍灰白色，鳍间膜夹杂许多细小黑斑点。臀鳍灰白色。尾鳍分叉，上下叶几乎等长，灰白色或浅黄色(图版-3，4)。

甲醛固定的样本头、背部灰黑色，腹部灰白色，背鳍黑色，尾鳍灰黑色(图版-1，2)。

地理分布：目前仅知分布于苕溪水系。

生境：生活于苕溪水系水流较平缓、底质为小型卵石或砾石的清澈浅水溪流中。

词源：新种种名“tiaoxiensis”为拉丁化的“苕溪的”意思，指该种的模式产地。

鉴别特征：新种与同一水系也有分布的棘颊形态上最为接近，但是二者在侧线鳞、侧线上鳞、侧线下鳞以及围尾柄鳞数目上都存在着较为明显的差异，如表 3所示：前者侧线上鳞为8行、侧线下鳞3~4行，平均为3.4行，以3行居多、侧线鳞为41~44枚，平均42.5枚、围尾柄鳞12~15枚，平均13.2枚；而棘颊侧线上鳞为8~10行，平均8.8行，以9行居多、侧线下鳞4~5行，平均为4.1行，以4行居多、侧线鳞为44~47枚，平均45.3枚，以45枚以上居多、围尾柄鳞14~17枚，平均15.2枚。另外在成熟雄鱼腹鳍的长度上也有差异，新种的腹鳍达到但不超过肛门，而棘颊的腹鳍超过肛门达到了臀鳍起点。如表 4(中华的数据引自朱兰等^[15]，宽鳍的数据引自HEE等^[25])所示，新种与中华的形态区别主要为侧线下鳞数目3~4(vs. 2~3)、眼间距与头长的比例35.0%~50.8%(vs. 32.0%~35.8%)以及成熟雄鱼的腹鳍到达肛门(vs. 未到达)。新种与宽鳍的形态区别主要在可比性状方面：头长与体长之比24.4%~28.2%(vs. 22.7%~24.8%)、背鳍前长与体长之比47.2%~51.9%(vs. 42.0%~47.6%)、尾柄长与体长之比16.5%~20.3%(vs. 20.6%~23.7%)、眼间距与头长之比35.0%~50.8%(vs. 28.3%~36.7%)。

3 系统发育分析

全长1 140 bp的Cytb基因序列中无碱基的插入或缺失，其A、T、G、C的碱基含量平均值(不含外群)分别为26.7%、30.2%、16.0%、27.1%。A + T含量(56.9%)高于G + C含量(43. 1%)，与鱼类线粒体基因A、T含量高，G、C含量低的特点一致。序列保守位点754个，占总位点数的66.1%；变异位点386个，占33.9%；单突变位点95个，占8.3%；简约信息位点291个，占25.5%。序列的转换颠换比为6.15。

以亚科的中华细鲫(Aphyocypris chinensis)作为外类群构建的Cytb基因NJ、ML和BI系统发育树具有相同的拓扑结构(图 1)。结果显示以条纹特征分类的属和马口鱼属各自构成单系群并为姐妹群关系。在属鱼类中, 除椒江群体外，苕溪水系的临安、新安江大部分样本和浙江其余水系样本与宁波的棘颊构成单系群，表明该群为棘颊无误，其与新种苕溪的单系群聚为支系Ⅰ，支持率为100/100/1(NJ/ML/BI)。椒江群体与黄山部分样本属于已发表的Zacco sp. A，黄河水系部分样本为Zacco sp.B，黄河水系部分样本与辽宁的样本为中华，与日本的宽鳍聚为支系Ⅱ，支持率为100/96/0.94(NJ/ML/BI)。

基于双参数模型计算了属各物种之间的遗传距离。新种与同属支系Ⅰ的棘颊平均遗传距离为3.9%，与支系Ⅱ内各物种间的平均遗传距离为8.1%~8.8%。支系Ⅱ的4个物种间的平均遗传距离为3.7%~5.0%。各物种种内群体间遗传距离为0.4%~1.2%。

4 讨论

属目前仅有3个已定名的有效种，即宽鳍、棘颊和中华。其中，模式种宽鳍分布于日本本岛，棘颊分布于长江中下游和浙江各水系, 中华分布于黄河和大凌河水系^[15]。新种苕溪与同一水系及浙江其他水系广泛分布的棘颊形态上最为相似，但是二者在侧线鳞、侧线上鳞、侧线下鳞以及围尾柄鳞数目等这些可数性状上存在着较为稳定的差异，如表 3所示。在棘颊的原始描述^[12]中，记载其侧线上鳞为9~10行、侧线下鳞为5~6行、侧线鳞为49~51枚，本研究观察的侧线鳞和侧线下鳞数目没有达到原始描述的上限，可能与检视标本数量有关。此外，在成熟雄鱼腹鳍的长度上也有差异，新种的腹鳍达到但不超过肛门，而棘颊的腹鳍超过肛门且达到臀鳍起点。新种与中华和宽鳍除了地理分布上的不同外，它们的形态区别主要在可比性状方面。如表 4(中华数据来自朱兰等^[15]，宽鳍数据来自HEE等^[25])所示，新种与中华的形态区别主要为侧线下鳞数目3~4 (vs. 2~3)、眼间距与头长的比例35.0%~50.8% (vs. 32.0%~35.8%) 以及成熟雄鱼的腹鳍到达肛门(vs. 未到达)。新种与宽鳍的形态区别主要在可比性状方面：头长与体长之比24.4%~28.2% (vs. 22.7%~24.8%)、背鳍前长与体长之比47.2%~51.9% (vs. 42.0%~47.6%)、尾柄长与体长之比16.5%~20.3% (vs. 20.6%~23.7%)、眼间距与头长之比35.0%~50.8% (vs. 28.3%~36.7%)。最后，生活时眼睛上缘的颜色被认为是属鱼类的一个稳定性状^[25]，眼睛上缘红色(vs. 黑色)在生活时可以容易地将新种与这2者鉴别出来。

基于Cytb基因全序列的系统发育关系分析进一步证实了以条纹特征分类的属鱼类的单系性。同时也支持苕溪水系存在着棘颊和苕溪2个物种，这2个物种间亲缘关系也最近，二者组成的支系与中华及宽鳍等组成的支系为姐妹群关系。WANG等^[14]以通用的3%线粒体Cytb基因遗传距离识别了中国属的棘颊和3个遗传谱系，并认为这3个遗传谱系对应着3个独立的物种。本研究基于Cytb基因的序列变异显示，新种苕溪与同属的各物种遗传距离均超过了3%，达到了物种分化水平，支持它们为不同的物种。

综上所述，基于形态和遗传分析皆表明苕溪应为独立物种。在地理分布上，新种苕溪目前仅知分布在苕溪水系，在相邻水系尚未发现其分布。