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半滑舌鳎 dnmt3a 基因的分子鉴定和功能  PDF

  • 孙衍旭 1,2,3
  • 龚小玲 1,2
  • 邵长伟 3,4
1. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306; 2. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306; 3. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 海水养殖生物育种与可持续产出国家重点实验室,山东 青岛 266071; 4. 青岛海洋科技中心海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室,山东 青岛 266237

中图分类号: S 917

最近更新:2025-05-21

DOI: 10.12024/jsou.20240704588

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摘要

为探究 dnmt3a 基因在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)性逆转过程中的调控作用,开发适用于半滑舌鳎的 DNA 甲基化编辑系统,克隆了半滑舌鳎 dnmt3a 基因的 CDS 区序列,并通过生物信息学分析其结构域特点以及进化过程中的保守性,利用 qPCR 分析了其在半滑舌鳎不同性别中的表达模式,探究了 DNA 甲基化酶抑制剂 5-Aza-dC 处理对 dnmt3a 基因表达的影响。结果表明,dnmt3a 基因全长 3 063 bp,编码 1 020 个氨基酸,包括3个核心结构域(PWWP 结构域、ADDz 结构域和 AdoMet_MTases 超家族),dnmt3a 基因结合结构域(PWWP 结构域、ADDz 结构域)相对保守,催化活性结构域(AdoMet_MTases 超家族)与哺乳动物和爬行动物有较大差异。基因表达模式分析表明,雌性半滑舌鳎性腺组织 dnmt3a 基因表达量显著高于雄性和伪雄性。5-Aza-dC 处理后, dnmt3a 基因表达显著升高。研究表明:dnmt3a 基因在 DNA 甲基化调控半滑舌鳎性别决定与分化过程中发挥重要作用,为阐明半滑舌鳎性逆转机制和实现半滑舌鳎单基因靶向DNA 甲基化编辑提供参考。

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一种环境敏感的鱼类,其性别决定系统为 ZW 型(即雄性基因型为 ZZ,雌性基因型为 ZW

1,是一种广泛分布在中国近海的经济比目鱼类。已有研究表明半滑舌鳎在高温影响下可以发生性别逆2,并且该现象及其造成的体型变化等特征与基因组甲基化水平有3。因此,半滑舌鳎是研究表观遗传调控的理想材料。

DNA 甲基化是由一系列 DNA 甲基转移酶(DNMTs)催化和维持的,最常见的DNA甲基化形式为发生在胞嘧啶C-5上的甲基化修饰。dnmt1、dnmt3adnmt3b 是 DNA 甲基转移酶家族的3种经典亚型。其中,dnmt3adnmt3b 通过将 S-腺苷蛋氨酸(SAM)的甲基转移到胞嘧啶残基的 C-5 位置,实现半修饰或未修饰的 DNA 新的甲基化模式建立,因此被称为从头甲基化酶(de novo dnmt

4-5dnmt3a 基因广泛调节生物体内的 DNA 甲基化水平,与生物生长、发育、衰老以及人类各种癌症相关。已有大量研究表明,dnmt3a 基因的缺失或突变,会引起人类白血6、乳腺肿7等疾病发生,是许多疾病早期诊断的重要指标,并为人类治愈相关疾病提供潜在的治疗靶标。此外,在水产育种中,有研究表明乌鳢(Channa argus)和斑鳢(Channa maculates)杂交子代乌斑鳢(乌鳢♀×斑鳢)所具有的杂种优势,也与 dnmt3a 基因介导的 DNA 甲基化变化有8

近年来,表观基因编辑领域取得了显著的进展,CRISPR/dCas9 技术成为实现精准表观基因编辑的强大工具。dnmt3a 基因作为关键的效应基因,通过 CRISPR/dCas9 技术的应用,成功实现了单基因靶向编辑 DNA 甲基化。在阿尔茨海默病的治疗研究中,利用CRISPR/dCas9-dnmt3a 系统靶向淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的启动子,并改变其 DNA 甲基化水平,提供了一种全新的治疗策

9。该系统在植物上也得以应用并实现靶向DNA甲基化编10。然而,在海洋生物中,以 dnmt3a 基因为 DNA 甲基化编辑效应酶的靶向编辑系统亟待开发,为了更好地了解 dnmt3a 基因在半滑舌鳎 DNA 甲基化调控中的作用,实现海洋生物单基因靶向 DNA 甲基化编辑,本研究克隆了半滑舌鳎的 dnmt3a 基因,并分析了其结构域特点,探究其在不同性别半滑舌鳎各组织中的表达模式。并通过 DNA 甲基化酶抑制剂 5-Aza‑2'‑deoxycytidine (5-Aza-dC11处理半滑舌鳎细胞,探究其对 dnmt3a 的表达影响。研究结果为半滑舌鳎 DNA 甲基化调控机制的深入研究及靶向单基因 DNA 甲基化编辑系统的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼

实验所用1龄半滑舌鳎购自中国青岛当地市场,于实验室海水饲养箱(提前使用高锰酸钾消毒)中饲养大于48 h 使其状态稳定,饲养海水盐度为16.0±0.5,饲养温度为(24±2)℃,每个饲养箱中放置2枚气石,使饲养箱中保持溶解氧充足。每日早晚2次喂食,每日21∶00换水,及时清理饲养箱中食物残渣与排泄废物。实验方案遵守中国科学技术部制定的《实验动物伦理待遇指南》。

1.2 半滑舌鳎性别鉴定

配置 DNA 裂解缓冲液[1 mL 1 mol/L Tris (pH=8)、2 mL 5 mol/L EDTA、1 mL Triton X-100,加 ddH2O 补足至 500 mL],在使用前加入蛋白酶 K,使其终浓度为 20 μg/ mL。捞取在实验室饲养箱中稳定饲养的健康 1 龄半滑舌鳎并编号,使用 MS-222将其麻醉后剪取约 10 mg 尾鳍鳍条放置于 200 μL 离心管中并加入 30 μL DNA 裂解缓冲液,将剪取尾鳍后的半滑舌鳎放回至饲养箱中,观察约 30 min 确保半滑舌鳎恢复至正常状态。鳍条 60 ℃裂解 15~30 min,95 ℃加热 5 min 后离心取上清通过 PCR 扩增法扩增半滑舌鳎基因组DNA 鉴定半滑舌鳎遗传性别。进行性别鉴定的 PCR 引物为 CS-sex-F/R,引物序列见表 1。PCR 扩增体系(20 μL):2 × Rapid Taq Master Mix 10 μL、引物CS-sex-F/R 0.5 μL/0.5 μL、基因组 DNA 1 μL、ddH2O 8 μL。反应程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s,设置 35 个循环;72 ℃ 5 min。使用 4% 的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳,电压 150 V,20 min。使用化学发光凝胶成像仪(Vilber,法国)观察电泳结果,只存在 169 bp 处单一条带为遗传雄鱼,存在 134 bp和 169 bp 双条带为遗传雌鱼。取遗传雌鱼的部分性腺,进行镜检观察,判断其生理性别,其中性腺发育为精巢的半滑舌鳎为伪雄鱼(ZWm)。

表1  引物名称和序列
Tab.1  Primer names and sequences

引物名称

Primer name

序列5'-3'

Sequence (5'-3')

目的

Application

CS-sex-F CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTC 性别鉴定
CS-sex-R GATCCAGAGAAAATAAACCCAGG
dnmt3a-1F ATGATGCCGTCCAACGCCGT 基因扩增
dnmt3a-1R ACTTAGGGCAGGTCTTGTCTCC
dnmt3a-2F GACAAGGACGAAGACAGCCTG
dnmt3a-2R CCACGTAGCGGTCCACCTGA
dnmt3a-3F AGGATTTTCAACCCCCAAAG
dnmt3a-3R TCAAACACAGGCAAAGTATTCT
β-actin-F GCTGTGCTGTCCCTGTA qPCR验证
β-actin-R GAGTAGCCACGCTCTGTC
dnmt3a-F CAGGTTGGTGTGTGAATGGC
dnmt3a-R GGAAAACCGAAGATCCTCTCCA

1.3 总 RNA 的提取和 cDNA 合成

分别选取健康 1 龄半滑舌鳎雌、雄、伪雄各 3 条,分别对其 10 个组织进行采样:性腺、肝、鳃丝、肾、心、肠、胃、肌肉、脾、脑。使用 Trizol 法进行总 RNA 提取,并使用 NanoDropTM OneC(ThermoFisher Scientific,美国)和 1% 琼脂糖凝胶电泳检测其质量与完整性。将 RNA 稀释至 1 000 ng/μL 备用。

使用 HiScript® Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)试剂盒(Vazyme,中国南京)进行全长 cDNA 合成,用于后续基因克隆;使用 Primescript RT Reagent kit with gDNA Eraser 反转录试剂盒(TaKaRa,日本)进行短链 cDNA 合成,用于后续 qPCR。将 cDNA 稀释5倍,于 -20 ℃ 储存备用。

1.4 半滑舌鳎 dnmt3a 基因 CDS 区克隆及鉴定

根据 NCBI 数据库中半滑舌鳎 DNA 甲基化转移酶 dnmt3a X1 的序列信息,采用 Primer Premier 5.0 软件进行 CDS 区分段克隆引物设计,引物序列见表1。使用 PrimeSTAR® Max DNA Polymerase 高保真酶进行分段扩增,体系(50 μL):PrimeSTAR Max Premix (2×) 25 μL、Primer-F/R 1 μL/1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 21 μL。反应程序:98 ℃ 3 min;98 ℃ 10 s,Tm (℃) 5 s,72 ℃ 30 s,设置 35 个循环。将分段 PCR 产物稀释 100 倍后混匀,作为模板再次进行 PCR 扩增,扩增引物分别使用 dnmt3a-1F 和 dnmt3a-3R,扩增体系与分段扩增时相同,扩增程序中延伸时间改为 1 min。纯化的 PCR 产物与 pEASY®-T1 载体[天根生化科技(北京)有限公司]连接,并转化至大肠杆菌感受态中,经蓝白斑筛选后送南京诺唯赞生物科技有限公司测序。

1.5 半滑舌鳎 dnmt3a 基因生信分析及系统发育树构建

使用 DNAMAN 比对测序序列和 NCBI 数据库中的 dnmt3a X1 基因的 CDS 序列,并分析其序列信息,使用 NCBI 在线工具(NCBI Conserved Domain Search)借助 NCBI's Conserved Domain Database 数据库预测半滑舌鳎 dnmt3a 基因结构

12-14

选取半滑舌鳎近缘物种以及在进化过程中处于关键位置的13个物种的氨基酸序列进行多重序列比对、构建系统发育树。使用 IQ-TREE 2(http://www.iqtree.org, last accessed July 6, 2024)工具进行系统发育树的构建,使用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进行系统发育推

15。使用工具 EMBL-EBI(https://www.ebi.ac.uk/)进行多序列比16

1.6 5-Aza-dC 处理

将 5-Aza-dC(Macklin®,C10749023)溶解于 100% 二甲基亚砜(DMSO)中,形成1×105 μmol/L 原液,4 ℃ 保存。用 IL-15 培养基(北京索莱宝科技有限公司)稀释原液,分别获得终浓度为 20、40和 80 μmol/L 的处理液。将本实验培养好的半滑舌鳎性腺细胞接种于 6 孔板中,并在完全培养基中过夜培养至密度为 70%~80%。随后,用不同浓度的 5-Aza-dC 处理液处理细胞 2 d,收集细胞进行后续检测。

1.7 qPCR 分析

使用 NCBI 的引物设计功能在半滑舌鳎 dnmt3a 基因开放阅读框(ORF)设计引物,以β-actin 基因作为内参基因,引物序列见表 1。用 QuantiNova SYBR PCR Mix Kit(20×500)试剂盒(Qiagen,德国)进行 qPCR 测定,在罗氏实时荧光定量 PCR 仪(Roche,瑞士)上进行 qPCR。qPCR 反应体系:SYBR Green Ⅰ 10 μL、Primer Mix 1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 8 μL。反应程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 5 s、60 ℃ 10 s,95 ℃ 15 s,循环数设定为40; 65 ℃ 1 min。实验样品设3个生物学重复,每个实验样品设3个技术重复。使用 2-ΔΔCt 方法计算不同处理下基因的相对表达。使用 GraphPad Prism 9.0(GraphPad, 美国)进行数据分析,使用 t 检验或 One-way ANOVA 确定统计学差异。

2 结果

2.1 半滑舌鳎 dnmt3a 基因的序列分析

半滑舌鳎 dnmt3a 基因含有 3 063 bp 的开放阅读框(ORF),共编码 1 020 个氨基酸,共包含3个核心结构域,分别为 PWWP 结构域(含有 Pro-Trp-Trp-Pro 保守结构,该结构域通常与 DNA 结合,作为转录因子调节各种发育过程)、ADDz 结构域(PHD 样锌指结构域,主要功能为与多肽位点结合,参与染色质介导的转录控制)和 AdoMet_MTases 超家族[催化活性结构域,利用 S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM 或 AdoMet)作为底物进行甲基转移,生成 S-腺苷-L-高半胱氨酸](图1)。

图1  半滑舌鳎 dnmt3a 基因序列分析

Fig.1  DNA Sequence analysis of dnmt3a in Chinese tongue sole

红色代表 PWWP 结构域,蓝色代表ADDz 结构域,绿色代表 AdoMet_MTases 超家族。

The PWWP domain is represented in red, the ADDz domain in blue, and the AdoMet_MTases superfamily in green.

2.2 半滑舌鳎 dnmt3a 基因同源性分析和系统进化树分析

将半滑舌鳎的 dnmt3a 基因的氨基酸序列与其他硬骨鱼类、哺乳类、鸟类和爬行类等已知的 dnmt3a 序列进行比较分析发现,中游和中下游氨基酸序列在物种中相对保守,相对保守的区域对应的是 dnmt3a 的 PWWP 结构域和 ADDz 结构域,而在其他位置相对保守性较低(图 2)。随后,将这些氨基酸序列进行建树分析与结构域分析,如图 3 所示,鱼类被单独聚在一支,与其他物种相分离,表明鱼类与哺乳类、鸟类和爬行类动物的 dnmt3a 基因在进化上关系相对较远。结构域预测同时印证了这一点,并且能够直观地观察到不同物种间 dnmt3a 在结合结构域上的保守性以及催化结构域上的差异性。

图2  dnmt3a 基因氨基酸序列的多序列比对分析

Fig.2  Sequencing analysis of dnmt3a amino acid sequence

图3  dnmt3a 的系统发育进化树及结构域分析

Fig.3  Phylogenetic analysis of dnmt3a amino acid sequences and analysis of domains

左侧为系统发育树;右侧为结构域分析。

Left is the phylogenetic analysis; Right is analysis of domains.

2.3 dnmt3a 基因在雌、雄半滑舌鳎各组织中的表达模式分析

dnmt3a 基因在 1 龄雌、雄半滑舌鳎的 10 个组织中均有表达。其中,dnmt3a基因在肝、肌肉、脾、胃、肾和脑中的表达在雌、雄间有显著差异(P<0.05),在肠、鳃丝和心中的表达量无显著差异(P>0.05)(图4)。对1龄雄、雌和伪雄半滑舌鳎性腺组织中 dnmt3a 的相对表达量进行比较分析,结果表明,雄鱼和伪雄鱼的性腺组织中 dnmt3a 基因的相对表达量没有显著差异(P>0.05),而在雌鱼的性腺组织中,dnmt3a 基因的相对表达量显著(P<0.01)高于雄鱼和伪雄鱼性腺组织(图5)。

图4  dnmt3a基因在雌、雄半滑舌鳎各组织中的相对表达量

Fig.4  Relative expression of dnmt3a in various tissues of male and female Cynoglossus semilaevis

* 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异显著(P<0.05);** 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异显著(P<0.01);*** 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异极显著(P<0.001);**** 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异极显著(P<0.000 1)。

* indicates significant differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.05);** indicates significant differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.01);*** indicates significant extremely differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.001);**** indicates significant extremely differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.000 1).

图5  dnmt3a 基因在不同性别半滑舌鳎性腺中的相对表达量

Fig.5  Relative expression of dnmt3a in different gonads of Cynoglossus semilaevis

**表示雌、雄、伪雄间差异较显著(P<0.01)。

** indicates a significant difference between male, pseudo-male and female (P<0.01).

2.4 不同浓度 5-Aza-dC 处理半滑舌鳎精巢细胞后 dnmt3a 基因的相对表达分析

对 1 龄半滑舌鳎精巢细胞进行不同浓度的 5-Aza-dC处理,结果显示,在 20 μmol/L和 40 μmol/L处理 2 d 后,dnmt3a 的相对表达量显著高于(P<0.01)未处理细胞,而在 80 μmol/L处理 2 d 后,dnmt3a 基因相对表达量并没有发生显著变化(图6)。

图6  不同浓度 5-Aza-dC 处理下的半滑舌鳎精巢细胞 dnmt3a 基因的相对表达量

Fig.6  Relative expression of dnmt3a in testis cells of Chinese tongue sole treated with different concentrations of 5-Aza-dC

**表示处理后差异较显著(P<0.01)。

** indicates significant difference after treatment (P<0.01).

3 讨论

DNA 甲基化转移酶(DNMTs)家族主要包括 dnmt1、dnmt2、dnmt3adnmt3b 等,这些甲基转移酶都有着类似的催化机制,其特点是在酶和底物碱基之间形成共价反应,从而实现甲基转

17。DNA 甲基化转移酶通过转录沉18、转录激19dnmt2 依赖性 tRNA 甲基化的转录后调20,进而调控生物生长、发育、衰老等生命进程。这种机制的多样性使 DNMTs 家族能够作为表观遗传调控的多功能工具包发挥作21dnmt3a 作为靶向编辑 DNA 甲基化的效应酶,通过 CRSPR/dCas9-dnmt3a DNA 甲基化编辑系统在小鼠、人类细胞中均已成功应用,并实现如阿尔兹海默症相关神经细胞死亡挽9、胶质瘤治疗新方法开22和抑制黑色素瘤细胞增23等。然而,该系统中使用的 dnmt3a 基因多为人源的 dnmt3a 基因的催化结构域,该系统能否直接应用于海水鱼类单基因靶向 DNA 甲基化、促进海水鱼类遗传育种还未可知。因此,本研究克隆并分析了半滑舌鳎 dnmt3a 基因,根据多序列比对以及系统发育进化树的结果可知,dnmt3a 在不同物种中相对保守。然而,其催化活性结构域在不同物种间却有着极大的差异,这种差异使得其催化底物不同,这提示我们,在哺乳动物中技术相对成熟的 CRISPR/dCas9-dnmt3a 系统或许并不能直接应用于海水鱼类的 DNA 甲基化编辑。

半滑舌鳎作为我国重要的海水经济鱼类,其生命进程受到表观遗传学,尤其是 DNA 甲基化修饰的调控。已有研

3表明,不同性别半滑舌鳎的全基因组 DNA 甲基化景观有着较大的差异。本研究猜测,dnmt3a 基因作为一种重要的 DNA 甲基化转移酶,在半滑舌鳎性别决定与分化中发挥着重要作用。本研究分析了不同性别半滑舌鳎各组织中 dnmt3a 基因的表达模式,结果表明,雄性(ZZ)和雌性(ZW)半滑舌鳎的肠、鳃丝和心等组织的表达模式相近。进一步比较了不同性别半滑舌鳎的性腺组织中 dnmt3a 的相对表达量,结果表明,雄鱼和伪雄鱼的 dnmt3a 基因表达量没有显著差异,而雌鱼的 dnmt3a 基因表达显著高于雄鱼和伪雄鱼。dmrt1 是半滑舌鳎的性别决定基因,其在伪雄鱼中的高表达,是半滑舌鳎发生型逆转现象的重要调控机制之一。在其他物种中,如锦龟(Chrysemys picta24、盲曹鱼(Lates calcarifer25以及与半滑舌鳎近缘的牙鲆(Paralichthys olivaceus26等物种中,均有研究表明,dmrt1 基因的表达受到 DNA 甲基化的调控。本研究推测,雌性半滑舌鳎性腺组织中高表达的 dnmt3a 基因可能与 dmrt1 基因 DNA 甲基化水平升高相关,从而抑制基因表达;而在雄鱼中,性腺中的 dnmt3a 基因表达量降低,使 dmrt1 基因 DNA 甲基化水平下降,从而激活 dmrt1 基因表达,使性腺逐渐朝着精巢方向发展。

DNA 甲基化调控是一套复杂的调控机制,并不能只靠单一的某种 DNA 甲基化转移酶实现生物学过程调控,通常认为,dnmt1 dnmt3adnmt3b 共同参与 DNA 甲基化调控过程。但是近年来在已完成的大量昆虫的全基因组和转录组中发现,部分昆虫在进化的过程中逐渐丢失某种 DNA 甲基化转移酶,但并不会影响其自身 DNA 甲基化的动态调

2127,这提示我们 DNMTs 家族的各成员并不只是行使单一功能,可能在一些情况下互为补充,因此,DNA甲基化转移酶间的补充关系亟待阐明。5-Aza‑2'‑deoxycytidine(5-Aza-dC)是一种广谱的 DNA 甲基化抑制剂,其作用机制为与 dnmt1 特异性结合,从而降低全基因组 DNA 甲基化水11。低浓度的 5-Aza-dC 能够降低基因组的 DNA 甲基化,激活基因表达并且在细胞周期 S 期时改变细胞的分化状28。本研究使用不同浓度的 5-Aza-dC 溶液处理半滑舌鳎精巢细胞,并检测处理后半滑舌鳎精巢细胞 dnmt3a 的相对表达量,结果表明,在20和40 μmol/L 浓度时,处理后的半滑舌鳎精巢细胞 dnmt3a 基因的表达量显著升高,这可能由于 dnmt1 被抑制活性后,dnmt3a 替代 dnmt1 基因维持细胞的 DNA 甲基化状态,但是这种补救措施的效率仍待阐明。此外,高浓度 5-Aza-dC 可抑制 DNA 的合成,诱导细胞死11。在本研究处理过程中,80 μmol/L 浓度处理造成大量细胞死亡,可能是 dnmt3a 表达量并未发生显著差异的原因之一。

综上所述,本研究克隆了半滑舌鳎 dnmt3a 基因,明确了其催化活性结构域与人类 dnmt3a 基因催化活性结构域的差异,为构建适用于半滑舌鳎等海水鱼类的 CRISPR/dCas9-dnmt3a 单基因靶向 DNA 甲基化编辑系统提供参考。本研究还发现雌鱼性腺组织的 dnmt3a 基因表达量显著高于雄鱼和伪雄鱼,推测 dnmt3a 在半滑舌鳎性逆转中起到重要作用。此外,探究了 5-Aza-dC 处理半滑舌鳎精巢细胞后dnmt3a 基因的表达变化。本研究为探究半滑舌鳎性逆转的表观调控机制及开展半滑舌鳎单基因靶向DNA甲基化提供参考。

利益冲突

作者声明本文无利益冲突

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