摘要
为探究 dnmt3a 基因在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)性逆转过程中的调控作用,开发适用于半滑舌鳎的 DNA 甲基化编辑系统,克隆了半滑舌鳎 dnmt3a 基因的 CDS 区序列,并通过生物信息学分析其结构域特点以及进化过程中的保守性,利用 qPCR 分析了其在半滑舌鳎不同性别中的表达模式,探究了 DNA 甲基化酶抑制剂 5-Aza-dC 处理对 dnmt3a 基因表达的影响。结果表明,dnmt3a 基因全长 3 063 bp,编码 1 020 个氨基酸,包括3个核心结构域(PWWP 结构域、ADDz 结构域和 AdoMet_MTases 超家族),dnmt3a 基因结合结构域(PWWP 结构域、ADDz 结构域)相对保守,催化活性结构域(AdoMet_MTases 超家族)与哺乳动物和爬行动物有较大差异。基因表达模式分析表明,雌性半滑舌鳎性腺组织 dnmt3a 基因表达量显著高于雄性和伪雄性。5-Aza-dC 处理后, dnmt3a 基因表达显著升高。研究表明:dnmt3a 基因在 DNA 甲基化调控半滑舌鳎性别决定与分化过程中发挥重要作用,为阐明半滑舌鳎性逆转机制和实现半滑舌鳎单基因靶向DNA 甲基化编辑提供参考。
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一种环境敏感的鱼类,其性别决定系统为 ZW 型(即雄性基因型为 ZZ,雌性基因型为 ZW
DNA 甲基化是由一系列 DNA 甲基转移酶(DNMTs)催化和维持的,最常见的DNA甲基化形式为发生在胞嘧啶C-5上的甲基化修饰。dnmt1、dnmt3a、dnmt3b 是 DNA 甲基转移酶家族的3种经典亚型。其中,dnmt3a、dnmt3b 通过将 S-腺苷蛋氨酸(SAM)的甲基转移到胞嘧啶残基的 C-5 位置,实现半修饰或未修饰的 DNA 新的甲基化模式建立,因此被称为从头甲基化酶(de novo dnmt
近年来,表观基因编辑领域取得了显著的进展,CRISPR/dCas9 技术成为实现精准表观基因编辑的强大工具。dnmt3a 基因作为关键的效应基因,通过 CRISPR/dCas9 技术的应用,成功实现了单基因靶向编辑 DNA 甲基化。在阿尔茨海默病的治疗研究中,利用CRISPR/dCas9-dnmt3a 系统靶向淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)的启动子,并改变其 DNA 甲基化水平,提供了一种全新的治疗策
实验所用1龄半滑舌鳎购自中国青岛当地市场,于实验室海水饲养箱(提前使用高锰酸钾消毒)中饲养大于48 h 使其状态稳定,饲养海水盐度为16.0±0.5,饲养温度为(24±2)℃,每个饲养箱中放置2枚气石,使饲养箱中保持溶解氧充足。每日早晚2次喂食,每日21∶00换水,及时清理饲养箱中食物残渣与排泄废物。实验方案遵守中国科学技术部制定的《实验动物伦理待遇指南》。
配置 DNA 裂解缓冲液[1 mL 1 mol/L Tris (pH=8)、2 mL 5 mol/L EDTA、1 mL Triton X-100,加 ddH2O 补足至 500 mL],在使用前加入蛋白酶 K,使其终浓度为 20 μg/ mL。捞取在实验室饲养箱中稳定饲养的健康 1 龄半滑舌鳎并编号,使用 MS-222将其麻醉后剪取约 10 mg 尾鳍鳍条放置于 200 μL 离心管中并加入 30 μL DNA 裂解缓冲液,将剪取尾鳍后的半滑舌鳎放回至饲养箱中,观察约 30 min 确保半滑舌鳎恢复至正常状态。鳍条 60 ℃裂解 15~30 min,95 ℃加热 5 min 后离心取上清通过 PCR 扩增法扩增半滑舌鳎基因组DNA 鉴定半滑舌鳎遗传性别。进行性别鉴定的 PCR 引物为 CS-sex-F/R,引物序列见
引物名称 Primer name | 序列5'-3' Sequence (5'-3') | 目的 Application |
---|---|---|
CS-sex-F | CCTAAATGATGGATGTAGATTCTGTC | 性别鉴定 |
CS-sex-R | GATCCAGAGAAAATAAACCCAGG | |
dnmt3a-1F | ATGATGCCGTCCAACGCCGT | 基因扩增 |
dnmt3a-1R | ACTTAGGGCAGGTCTTGTCTCC | |
dnmt3a-2F | GACAAGGACGAAGACAGCCTG | |
dnmt3a-2R | CCACGTAGCGGTCCACCTGA | |
dnmt3a-3F | AGGATTTTCAACCCCCAAAG | |
dnmt3a-3R | TCAAACACAGGCAAAGTATTCT | |
β-actin-F | GCTGTGCTGTCCCTGTA | qPCR验证 |
β-actin-R | GAGTAGCCACGCTCTGTC | |
dnmt3a-F | CAGGTTGGTGTGTGAATGGC | |
dnmt3a-R | GGAAAACCGAAGATCCTCTCCA |
分别选取健康 1 龄半滑舌鳎雌、雄、伪雄各 3 条,分别对其 10 个组织进行采样:性腺、肝、鳃丝、肾、心、肠、胃、肌肉、脾、脑。使用 Trizol 法进行总 RNA 提取,并使用 NanoDro
使用 HiScrip
根据 NCBI 数据库中半滑舌鳎 DNA 甲基化转移酶 dnmt3a X1 的序列信息,采用 Primer Premier 5.0 软件进行 CDS 区分段克隆引物设计,引物序列见
使用 DNAMAN 比对测序序列和 NCBI 数据库中的 dnmt3a X1 基因的 CDS 序列,并分析其序列信息,使用 NCBI 在线工具(NCBI Conserved Domain Search)借助 NCBI's Conserved Domain Database 数据库预测半滑舌鳎 dnmt3a 基因结构
选取半滑舌鳎近缘物种以及在进化过程中处于关键位置的13个物种的氨基酸序列进行多重序列比对、构建系统发育树。使用 IQ-TREE 2(http://www.iqtree.org, last accessed July 6, 2024)工具进行系统发育树的构建,使用邻接法(Neighbor-Joining, NJ)进行系统发育推
将 5-Aza-dC(Mackli
使用 NCBI 的引物设计功能在半滑舌鳎 dnmt3a 基因开放阅读框(ORF)设计引物,以β-actin 基因作为内参基因,引物序列见
半滑舌鳎 dnmt3a 基因含有 3 063 bp 的开放阅读框(ORF),共编码 1 020 个氨基酸,共包含3个核心结构域,分别为 PWWP 结构域(含有 Pro-Trp-Trp-Pro 保守结构,该结构域通常与 DNA 结合,作为转录因子调节各种发育过程)、ADDz 结构域(PHD 样锌指结构域,主要功能为与多肽位点结合,参与染色质介导的转录控制)和 AdoMet_MTases 超家族[催化活性结构域,利用 S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM 或 AdoMet)作为底物进行甲基转移,生成 S-腺苷-L-高半胱氨酸](

图1 半滑舌鳎 dnmt3a 基因序列分析
Fig.1 DNA Sequence analysis of dnmt3a in Chinese tongue sole
红色代表 PWWP 结构域,蓝色代表ADDz 结构域,绿色代表 AdoMet_MTases 超家族。
The PWWP domain is represented in red, the ADDz domain in blue, and the AdoMet_MTases superfamily in green.
将半滑舌鳎的 dnmt3a 基因的氨基酸序列与其他硬骨鱼类、哺乳类、鸟类和爬行类等已知的 dnmt3a 序列进行比较分析发现,中游和中下游氨基酸序列在物种中相对保守,相对保守的区域对应的是 dnmt3a 的 PWWP 结构域和 ADDz 结构域,而在其他位置相对保守性较低(

图2 dnmt3a 基因氨基酸序列的多序列比对分析
Fig.2 Sequencing analysis of dnmt3a amino acid sequence

图3 dnmt3a 的系统发育进化树及结构域分析
Fig.3 Phylogenetic analysis of dnmt3a amino acid sequences and analysis of domains
左侧为系统发育树;右侧为结构域分析。
Left is the phylogenetic analysis; Right is analysis of domains.
dnmt3a 基因在 1 龄雌、雄半滑舌鳎的 10 个组织中均有表达。其中,dnmt3a基因在肝、肌肉、脾、胃、肾和脑中的表达在雌、雄间有显著差异(P<0.05),在肠、鳃丝和心中的表达量无显著差异(P>0.05)(

图4 dnmt3a基因在雌、雄半滑舌鳎各组织中的相对表达量
Fig.4 Relative expression of dnmt3a in various tissues of male and female Cynoglossus semilaevis
* 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异显著(P<0.05);** 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异显著(P<0.01);*** 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异极显著(P<0.001);**** 表示雌、雄性间比较,dnmt3a基因表达差异极显著(P<0.000 1)。
* indicates significant differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.05);** indicates significant differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.01);*** indicates significant extremely differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.001);**** indicates significant extremely differences in dnmt3a expression when comparing between females and males (P<0.000 1).

图5 dnmt3a 基因在不同性别半滑舌鳎性腺中的相对表达量
Fig.5 Relative expression of dnmt3a in different gonads of Cynoglossus semilaevis
**表示雌、雄、伪雄间差异较显著(P<0.01)。
** indicates a significant difference between male, pseudo-male and female (P<0.01).
对 1 龄半滑舌鳎精巢细胞进行不同浓度的 5-Aza-dC处理,结果显示,在 20 μmol/L和 40 μmol/L处理 2 d 后,dnmt3a 的相对表达量显著高于(P<0.01)未处理细胞,而在 80 μmol/L处理 2 d 后,dnmt3a 基因相对表达量并没有发生显著变化(

图6 不同浓度 5-Aza-dC 处理下的半滑舌鳎精巢细胞 dnmt3a 基因的相对表达量
Fig.6 Relative expression of dnmt3a in testis cells of Chinese tongue sole treated with different concentrations of 5-Aza-dC
**表示处理后差异较显著(P<0.01)。
** indicates significant difference after treatment (P<0.01).
DNA 甲基化转移酶(DNMTs)家族主要包括 dnmt1、dnmt2、dnmt3a和dnmt3b 等,这些甲基转移酶都有着类似的催化机制,其特点是在酶和底物碱基之间形成共价反应,从而实现甲基转
半滑舌鳎作为我国重要的海水经济鱼类,其生命进程受到表观遗传学,尤其是 DNA 甲基化修饰的调控。已有研
DNA 甲基化调控是一套复杂的调控机制,并不能只靠单一的某种 DNA 甲基化转移酶实现生物学过程调控,通常认为,dnmt1 和 dnmt3a、dnmt3b 共同参与 DNA 甲基化调控过程。但是近年来在已完成的大量昆虫的全基因组和转录组中发现,部分昆虫在进化的过程中逐渐丢失某种 DNA 甲基化转移酶,但并不会影响其自身 DNA 甲基化的动态调
综上所述,本研究克隆了半滑舌鳎 dnmt3a 基因,明确了其催化活性结构域与人类 dnmt3a 基因催化活性结构域的差异,为构建适用于半滑舌鳎等海水鱼类的 CRISPR/dCas9-dnmt3a 单基因靶向 DNA 甲基化编辑系统提供参考。本研究还发现雌鱼性腺组织的 dnmt3a 基因表达量显著高于雄鱼和伪雄鱼,推测 dnmt3a 在半滑舌鳎性逆转中起到重要作用。此外,探究了 5-Aza-dC 处理半滑舌鳎精巢细胞后dnmt3a 基因的表达变化。本研究为探究半滑舌鳎性逆转的表观调控机制及开展半滑舌鳎单基因靶向DNA甲基化提供参考。
利益冲突
作者声明本文无利益冲突
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