中华绒螯蟹Bco1基因的表达模式及其对高pH胁迫的响应

熊静怡，张敏，杨宗霖，陈晓武，姜晓东，成永旭，赵金山，吴旭干; XIONG Jingyi; ZHANG Min; YANG Zonglin; CHEN Xiaowu; JIANG Xiaodong; CHENG Yongxu; ZHAO Jinshan; WU Xugan

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成永旭 ^1,2,3,4
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吴旭干 ^1,2,3,4
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1. 上海海洋大学农业农村部鱼类营养和环境生态研究中心，上海 201306； 2. 东营市惠泽农业科技有限公司，山东东营 257503； 3. 上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心，上海 201306； 4. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306

中图分类号： S 917.4

最近更新：2025-05-21

DOI： 10.12024/jsou.20240404521

目录contents

摘要

结合生物信息学、实时荧光定量PCR、原位杂交及HPLC技术研究了中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）Bco1基因的序列特征、时空表达模式和亚细胞定位，并探讨了高pH慢性胁迫下肝胰腺的Es-Bco1表达量、色泽及类胡萝卜素含量的变化。结果表明：（1）Es-Bco1开放阅读框（Open reading frame，ORF）全长1 614 bp，编码537个氨基酸，属于RPE65超家族，并与三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）BCO1高度相似；（2）Es-Bco1在多个组织中均有表达，高表达于内膜、眼柄和肝胰腺；蜕壳周期中蜕壳后期（AB期）肝胰腺Es-Bco1表达量最高；卵巢发育阶段Ⅰ~Ⅲ期的肝胰腺Es-Bco1表达量显著上升，此后显著下降；（3）原位杂交结果显示，在蜕壳AB期和卵巢发育Ⅲ期，Es-Bco1 mRNA主要定位于肝胰腺的F细胞（纤维细胞）和R细胞（吸收细胞）中；（4）幼蟹在pH 8.0（对照）、9.0和10.0条件下胁迫30 d后，肝胰腺中的Es-Bco1表达水平显著上调，其肝胰腺亮度值（L^*）、黄度值（b^*）、总类胡萝卜素及β-胡萝卜素含量显著下降。综上，中华绒螯蟹Bco1主要在内膜、眼柄和肝胰腺中表达，且在蜕壳后期和卵巢Ⅲ期肝胰腺中高表达。此外，高pH胁迫可导致肝胰腺中Es-Bco1上调，降低类胡萝卜素含量，表明Bco1在中华绒螯蟹响应高pH胁迫过程中类胡萝卜素裂解起着重要作用。

关键词

中华绒螯蟹; β-胡萝卜素15，15'加氧酶（BCO1）; 基因表达; 亚细胞定位; pH胁迫

类胡萝卜素是自然界中广泛存在的一类天然色素，是生物体颜色多样的重要物质基础^［

1-2］。在自然界上，仅少数昆虫［如：烟粉虱（Bemisia tabaci）、柑橘木虱（Diaphorina citri）等］能够通过胞内共生细菌合成类胡萝卜素^{［参考文献 3-4}3-4］，绝大多数动物必须通过食物摄取类胡萝卜素^{［参考文献 5

百度学术}5］。在动物体内，类胡萝卜素不仅是维生素A的前体，对视力、细胞生长和分化至关重要^{［参考文献 6

百度学术}6］，且具有色泽调控、提高抗氧化能力和免疫性能等多种生理功能^{［参考文献 7

百度学术}7］。因此，动物体摄入一定量的类胡萝卜素至关重要^{［参考文献 2

百度学术}2］。

动物体摄入类胡萝卜素后，通常需要通过类胡萝卜素裂解酶转化为类维生素A和其他代谢物，才能进一步行使其生理功能^［

8-9］，如：β-胡萝卜素经过类胡萝卜素裂解酶裂解为两个视黄醛，此后可进一步转化为视黄酸、视黄醇和视黄醇酯参与多种生理调控^{［参考文献 10

百度学术}10］。因此，酶降解是类胡萝卜素利用的关键步骤，有研究^{［参考文献 11

百度学术}11］表明绝大部分生物体中都存在类胡萝卜素裂解酶（Carotenoid cleavage oxygenase，CCO）。在脊椎动物中发现类胡萝卜素裂解加氧酶有两种类型，分别命名为β -胡萝卜素15，15′ 加氧酶（BCO1或BCMO）和β -胡萝卜素9′，10′ 双加氧酶（BCO2或BCDO2）^{［参考文献 12-13}12-13］。其中，前者可以通过对称切割β-胡萝卜素的15，15′双键，将类胡萝卜素切割成两个全反式视黄醛^{［参考文献 14

百度学术}14］；后者主要催化不对称裂解，可使β-胡萝卜素在9′与l0′之间的双键断裂，生成β-胡萝卜醛和β-紫罗酮^{［参考文献 13

百度学术}13］。有研究表明，BCO1是维生素A产生的关键酶，主要在细胞质中起作用，如：人类Bco1基因突变后，体内β-胡萝卜素含量升高，而维生素A含量降低^{［参考文献 15

百度学术}15］；BCO2是一种与内膜相关的线粒体酶，可催化多种类胡萝卜素（包括胡萝卜素和叶黄素类），在小鼠肝脏中，缺乏Bco2会导致玉米黄质和叶黄素等底物在线粒体内膜上积累^{［参考文献 8

百度学术}8］。

有关节肢动物中类胡萝卜素裂解酶的研究相对较少，在昆虫中仅发现了一种具有氧化分解和异构化双重功能的酶——NinaB。NinaB通过对称切割β-胡萝卜素的15，15′双键，将一分子β-胡萝卜素切割成一分子11-顺式视黄醛和一分子全反式视黄醛^［

16］。进一步研究^{［参考文献 9

百度学术}9，17］表明，NinaB不仅对昆虫的视觉功能至关重要，且会影响家蚕的繁殖性能。迄今为止，有关甲壳动物类胡萝卜素裂解酶的研究刚刚起步，仅在脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）和中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）中有少量报道，在脊尾白虾和中华绒螯蟹基因组中均发现了多个有表达的类胡萝卜素加氧酶基因^{［参考文献 18-19}18-19］，其中脊尾白虾EcBCO-like 6被干扰后，肝胰腺颜色加深，且β-胡萝卜素含量增加，EcBCO-like 1被干扰后成活率显著下降^{［参考文献 18

百度学术}18］。进一步，通过分别敲除脊尾白虾中EcBCO2和EcNinaB，均发现敲除后脊尾白虾抗病能力增强，肝胰腺颜色变深^{［参考文献 20-21}20-21］，这说明CCO基因在甲壳动物正常生长发育过程中起着极其重要的作用。

中华绒螯蟹俗称河蟹，由于其蒸煮后具有鲜红色的甲壳、独特的风味和丰富的营养价值，故深受消费者的喜爱^［

22］。自20世纪90年代以来，市场对中华绒螯蟹的需求量不断增加^{［参考文献 23

百度学术}23］，中华绒螯蟹养殖业迅速发展，2022年养殖产量约815 318 t^{［参考文献 24

百度学术}24］，池塘养殖是最主要的养殖方式^{［参考文献 25

百度学术}25］。中华绒螯蟹室外池塘养殖过程中，大量换水、雨水注入、浮游生物种群更替以及水体污染等均会引起水体pH的变化。水体pH变化对其生长发育具有重要影响，不同pH会影响幼蟹发育和非特异性免疫，导致肝胰腺白化和免疫力下降^{［参考文献 26-27}26-27］，加上饵料中缺乏类胡萝卜素，可能会导致池塘养殖中华绒螯蟹成蟹煮熟后壳色、卵巢和肝胰腺颜色较淡，在一定程度上影响其商品价值^{［参考文献 28

百度学术}28］。因此，系统研究中华绒螯蟹类胡萝卜素裂解酶基因表达模式及功能，不仅可以帮助理解甲壳动物类胡萝卜素的分解代谢规律，且有利于在中华绒螯蟹养殖过程中开展营养调控和环境调控，促进中华绒螯蟹养殖业的可持续发展。

本研究首先分析了中华绒螯蟹β-胡萝卜素裂解酶基因Es-Bco1的基因特征及预测结构等，然后研究了该基因在不同组织、不同蜕壳期和卵巢发育阶段的表达模式，进一步通过原位杂交技术研究了该基因在肝胰腺中的表达定位，最后探讨了高pH慢性胁迫下肝胰腺的Es-Bco1表达量、色泽及类胡萝卜素含量变化情况，旨在初步探究Bco1在甲壳动物生长发育过程中的生理功能及水体高pH对甲壳动物类胡萝卜素代谢的影响，为深入理解甲壳动物类胡萝卜素的分解代谢机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验用蟹及组织取样

实验用蟹均来自上海海洋大学崇明科研基地。不同批次实验用蟹均为附肢健全、体质量接近和活力较好的个体。实验方案经上海海洋大学动物伦理委员会批准，并遵守中国科学技术部制定的《实验动物伦理待遇指南》。

挑选平均体质量为（11.2±2.3）g的池塘养殖生长蜕壳阶段的雌体幼蟹，活体运输到上海海洋大学室内循环水养殖系统中暂养，水槽（长×宽×高=2.50 m×0.60 m×0.25 m）水深12 cm，每个水槽放养30只幼蟹。蜕壳后的个体立即移入养殖盒（长×宽×高=34 cm×24 cm×18 cm）中单个体养殖，准确记录蜕壳日期和初始体质量。根据中华绒螯蟹蜕壳分期的外部形态学特征^［

29］，分别取蜕壳后期（AB期）、蜕壳间期（C期）、蜕壳前期（D期）和蜕壳期（E期）幼蟹8~9只用于解剖。解剖取出部分肝胰腺组织于液氮速冻后，-80 ℃保存，用于后续基因表达量研究；同时采集小块肝胰腺组织放入4%多聚甲醛中过夜固定后转移至75%乙醇中保存，用于原位杂交。

分别挑选生殖蜕壳前（卵巢发育Ⅰ期）和生殖蜕壳后（卵巢发育Ⅱ~Ⅴ期）的池塘养殖雌蟹，活体运输到上海海洋大学，生殖蜕壳前雌蟹平均体质量为（67.9±7.0）g，生殖蜕壳后的雌蟹平均体质量为（113.0±9.4）g。在室内循环水养殖系统中进行群养，养殖桶为500 L的PE桶（直径×高度=108 cm×120 cm），每只桶养殖10~12只雌蟹，暂养7~10 d开始采样，暂养期间投喂配合饲料（澳华成蟹3#，蛋白质含量为41.3%，粗脂肪含量为14.5%，浙江澳华饲料有限公司）。根据卵巢外观和组织学对卵巢发育进行分期^［

30］，每个卵巢发育时期（Ⅰ~Ⅴ期）均随机取10只雌蟹进行解剖。其中，采集生殖蜕壳前成蟹的肝胰腺、心脏、甲壳内膜、肌肉、胃、眼柄、后肠和鳃组织用于组织特异性分析。

1.2 RNA提取及cDNA合成

通过Trizol法提取各组织的总RNA，采用NanoDrop 2 000微量紫外分光光度计（ThermoFisher Scientific，美国）测定其浓度和纯度，采用1% 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，将合格的RNA保存于-80 ℃冰箱中。随后以提取的总RNA为模板，使用Evo-M-MLV反转录试剂盒（AG11706，湖南艾科瑞生物工程有限公司）进行cDNA转录合成。

1.3 基因克隆与序列分析

利用Local Blast分析中华绒螯蟹转录组数据（PRJNA660118）以及基因组数据（GCA_024679095.1）得到了Es-Bco1的CDS序列。利用Primer Premier 5.0软件设计该基因中间片段的特异性引物（表1），以肝胰腺cDNA为模板进行PCR扩增，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物使用普通琼脂糖凝胶试剂盒回收［天根生化科技（北京）有限公司］。然后将目的片段连接至pMD19-T（TaKaRa，日本），转化至DH5α感受态细胞（TaKaRa，日本）中克隆筛选，并将阳性克隆菌株送测。引物合成及测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究生物信息学分析使用软件及网址见表2。

表 1 本文所用引物信息

Tab.1 Primer information of the study

引物名称 Primer name	引物序列(5'–3') Sequence (5'–3')	用途 Usage
Es-Bco1-1F	ATGGAGCAGCAACAAGAAGAG	验证ORF引物
Es-Bco1-1R	GGAATCTGGAACGATAGGTAAC	验证ORF引物
Es-Bco1-2F	TCGTTCCAGATTCCTTCGC	验证ORF引物
Es-Bco1-2R	AGAAGCAGGTCTCCGTCAGG	验证ORF引物
Es-Bco1-3F	CCGACAACTGCTTAGTGAACG	验证ORF引物
Es-Bco1-3R	GCTGCTTCATGTTCCTAGCGT	验证ORF引物
qRT-Es-Bco1-F	CAGCAACAAGAAGAGAACCG	qRT-PCR引物
qRT-Es-Bco1-F	GCGAAGGAATCTGGAACGA	qRT-PCR引物
β-Actin-F	GCATCCACGAGACCACTTACA	qRT-PCR引物
β-Actin-R	CTCCTGCTTGCTGATCCACATC	qRT-PCR引物
Es-Bco1-ish-dsF	TAATACGACTCACTATAGGGCAGCAACAAGAAGAGAACCG	ISH引物
Es-Bco1-ish-R	CATGAGCCGATGAAACAAAGT	ISH引物
Es-Bco1-ish-F	CAGCAACAAGAAGAGAACCG	ISH引物
Es-Bco1-ish-dsR	TAATACGACTCACTATAGGGCATGAGCCGATGAAACAAAGT	ISH引物

表2 生物信息学分析工具

Tab.2 Bioinformatics analysis tool

目的 Aim	工具 Tool	网址 Website	参数设置 Parameter setting
氨基酸序列预测	SMS	http://www.bio-soft.net/sms/	90
蛋白理化性质分析	Protparam	http://web.expasy.org/protparam/	默认
染色体定位可视化	TB tools	无	默认
基因结构分析	Splign	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi	默认
信号肽分析	SignalP	http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/	默认
跨膜结构分析	TMHMM-2.0	http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/	默认
蛋白质结构域分析	Pram	http://pafm.xfam.org/search	默认
三级结构预测	SWISS-MODEL	https://swissmodel.expasy.org/interactive	默认
序列比对	BioEdit软件	无	默认
保守基序	MEME	https://meme-suite.org/meme/doc/meme.html	10
进化分析	MEGA 11.0	无	邻接法（NJ）

1.4 Es-Bco1组织特异性及表达模式分析

根据所获得的Es-Bco1序列，采用Primer Premier 5.0软件设计荧光定量PCR（qPCR）的引物序列（表1），以中华绒螯蟹β-actin作为内参基因，采用BIO-RAD荧光定量PCR分析仪（CFX384 Touch，BIO-RAD，USA）使用SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司），按照试剂盒说明书研究Es-Bco1在中华绒螯蟹不同组织、蜕壳周期和卵巢发育各阶段的表达特征，每个组织有6只生物学样本重复，每个样本重复3孔。当目标基因无非特异性扩增，且扩增效率在95%~105%时，确定qPCR的反应体系与条件，见表3，扩增程序：95 ℃ 预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共进行40个循环。溶解曲线的PCR程序：65~95 ℃，升温0.5 ℃/次，5 s/次。

表3 Es-Bco1与β-actin基因荧光定量PCR反应体系中各试剂添加量

Tab.3 The volume of each reagent added to the PCR mixture used for qRT-PCR ( μL )

试剂Reagent	Es-Bco1	β-actin
SYBR Premix Ex Taq^TM (2×)	5.0	5.0
PCR Forward Primer(10 μmol/L)	0.4	0.4
PCR Reverse Primer(10 μmol/L)	0.4	0.4
cDNA template	0.8	0.8
dH₂O	3.4	3.4
总体积Total volume/μL	10.0	10.0

1.5 原位杂交

使用地高辛（DIG）RNA标记试剂盒（Roche，Basel，Switzerland）和Transcript Aid T7高产转录试剂盒（ThermoFisher Scientific，美国），按照试剂盒说明书合成正义和反义探针，所用引物见表1，具体操作步骤参照潘柯伍^［

31］的研究方法。使用尼康显微镜（Nikon Eclipse 80i，Japan）进行观察和拍照。

1.6 pH胁迫实验

根据河蟹养殖池塘水体的pH变化范围，分别设置8.0、9.0、10.0等3个pH组，河蟹养殖于塑料盒（长×宽×高=55 cm×40 cm×25 cm）内，每个塑料盒中放25只幼蟹（体质量5~7 g，处于蜕壳间期），每个pH设置3个重复组。采用0.1 mol/L的氢氧化钠或盐酸调节水体pH，每隔8 h调整1次；每日下午投喂幼蟹配合饲料，次日上午清除残饵和记录死亡情况；胁迫30 d后采样，取出部分肝胰腺组织液氮速冻后，置于RNA保存液中-80 ℃保存，用于后续荧光定量PCR分析，具体实验步骤同1.4节；剩余肝胰腺组织避光保存于-40 ℃，用于色泽测定及类胡萝卜素含量测定。

1.7 肝胰腺色泽及类胡萝卜素含量测定

使用色差仪（CR-400，Konica Minolta Marunouchi，日本）测定中华绒螯蟹肝胰腺的色泽（L^*值，a^*值和b^*值，分别代表亮度值，红度值和黄度值），在避光条件下用吸水纸擦干装有肝胰腺的自封袋表面水分，随后在肝胰腺样品选择3个相对光滑的点进行L^*值、a^*值和b^*值测定。

避光条件下，取0.2~0.3 g肝胰腺湿样加入丙酮后涡旋震荡混匀，超声震荡10 min后离心，取出上清液。随后，使用丙酮进行4~5次重复提取，直到提取液无色，将所有上清液合并用于后续测定。采用分光光度计（T6新世纪，北京普析通用仪器有限责任公司）测定提取液在波长470 nm下的OD值。以纯化的虾青素（纯度：95.2%，Dr.ehrenstorfer，德国）为标准品，制备标准曲线，根据标准曲线计算样品中总类胡萝卜素含量。采用高效液相色谱（HPLC）法对样品中类胡萝卜素进行分离和定量，具体方法参照孙秋凤等^［

32］。

1.8 数据处理

所有实验数据以平均值±标准误（Mean±SE）表示。采用2 $^{- Δ Δ C_{t}}$ 法计算基因的相对表达量^［

33］。利用SPSS 22.0对基因表达量数据进行统计分析，采用Levene's法进行方差齐性检验，当不满足齐性方差时对百分比数据进行反正弦或平方根处理，采用单因素方差分析（ANOVA）对实验数据进行方差分析以确定差异是否显著。如果检测到显著差异，采用Duncan's法对结果进行多重比较，P<0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 中华绒螯蟹Bco1基因生物信息学分析

中华绒螯蟹Bco1的开放阅读框（ORF）全长为1 614 bp（包括终止密码子），编码537个氨基酸（图1），该蛋白预测理论等电点为5.95，预测分子量为60.69 ku，没有跨膜区和信号肽。EsBCO1在19~529 aa处具有RPE65结构域，为CCO家族的保守结构域。图2显示Es-Bco1基因含有4个外显子和3个内含子。多序列比对分析显示（图3a），中华绒螯蟹与三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）BCO1的相似性最高，为73.08%；与美洲螯龙虾（Homarus americanus）和克氏原螯虾（Procambarus clarkii）的相似度分别为43.28%和42.88%。这4个物种的BCO1蛋白比较保守，但是中华绒螯蟹和三疣梭子蟹出现了LPKVA和KISS序列的缺失。系统发育树分析结果显示（图3b），中华绒螯蟹EsBCO1与三疣梭子蟹聚为一支，美洲螯龙虾和克氏原螯虾聚为另一分支。进一步分析表明，这13个物种的BCO均具有RPE65结构域。对BCO1的保守基序分析发现，13个物种中共检测到10个Motif，其中所有的物种BCO1中均含有Motif 1-6和Motif 8，但软甲纲和线虫纲均缺少Motif 10。

图1 中华绒螯蟹Bco1基因的开放阅读框（ORF）及其推导的氨基酸序列

Fig.1 Open reading frame （ORF） of Bco1 gene and its derived amino acid sequence of Eriocheir sinensis

ATG.起始密码子；*.终止密码子；下划线及蓝色部分为Es-Bco1基因RPE65结构域。

ATG.start codon； *.Stop codon； The underlined and blue parts are the RPE65 domain of Es-Bco1 gene.

图2 中华绒螯蟹Bco1基因结构

Fig.2 Gene structure of Bco1 of Eriocheir sinensis

A，B，C代表内含子；方框区域代表外显子。

A， B， and C stand for introns； The box areas represent exons.

图3 中华绒螯蟹和其他物种的BCO1氨基酸序列比对及其系统进化树

Fig.3 Multiple sequence alignment and phylogenetic tree of BCO1 between Eriocheir sinensis and the other animal species

（a）黑色背景表示完全一致的氨基酸序列，灰色背景表示相似氨基酸序列，红色划线区域为RPE65结构域，蓝色虚线框为缺失片段LPKVA和KISS。

（a）The black background represents the identical amino acid sequence， the gray background represents the similar amino acid sequence， the red underlined area is the RPE65 domain， and the blue dashed box represents the missing fragments LPKVA and KISS.

2.2 Es-Bco1基因的组织特异性及时空表达分析

qPCR结果显示，Es-Bco1在河蟹的鳃、眼柄、内膜、肌肉、后肠、肝胰腺、胃和心脏中均有表达（图4）。其中，内膜中Es-Bco1 mRNA的相对表达量显著高于其他组织（P<0.05），其次为眼柄和肝胰腺，在其余组织中表达量较低，特别是心脏中的表达量最低（P<0.05）。就河蟹蜕壳周期而言，肝胰腺中Es-Bco1 mRNA的相对表达量变化显著（图5a），AB期最高，C期快速下降（P<0.05），D期继续下降至最低水平，但C期和D期差异不显著（P>0.05），E期又显著上升（P<0.05），见图5a。就不同卵巢发育阶段而言，肝胰腺中Es-Bco1 mRNA的表达量也存在显著变化（图5b），卵巢Ⅰ期和Ⅱ期，肝胰腺中Es-Bco1 mRNA的相对表达量均较低（P>0.05），Ⅲ期肝胰腺中Es-Bco1 mRNA表达水平快速上升至最高水平（P<0.05），在Ⅳ期显著下降（P<0.05），Ⅴ期继续下降至最低表达水平，但Ⅳ期和Ⅴ期肝胰腺中Es-Bco1 mRNA表达水平不存在显著差异（P>0.05），见图5b。

图 4 中华绒螯蟹不同组织中Es-Bco1 mRNA的相对表达量

Fig.4 Relative expression levels of Es-Bco1 mRNA in different tissues of Eriocheir sinensis

柱状图上方含有不同字母表示差异显著（P<0. 05）。

Different letters above the bar chart indicate significant differences（P<0. 05）.

图5 中华绒螯蟹肝胰腺中Es-Bco1 mRNA在不同蜕壳阶段和不同卵巢发育阶段的相对表达量变化

Fig.5 Relative expression levels of Es-Bco1 mRNA in the hepatopancreas during the different molting stages and different ovarian developmental stages of Eriocheir sinensis

AB期.蜕壳后期；C期.蜕壳间期；D期.蜕壳前期；E期.蜕壳期；Ⅰ~Ⅴ分别代表卵巢发育Ⅰ~Ⅴ期。柱状图上方含有不同字母表示差异显著（P<0. 05）。

Stage AB.postmolt stage； C stage.intermolt stage； Stage D.premolt stage； Stage E.ecdysis stage； Ⅰ-Ⅴ respectively represent the stages of ovarian development Ⅰ-Ⅴ. Different letters above the bar chart indicate significant differences （P<0. 05）.

2.3 Es-Bco1在肝胰腺中的mRNA定位

原位杂交结果（图版）显示，在蜕壳AB期Es-Bco1 mRNA在中华绒螯蟹肝胰腺中出现了明显的阳性信号，且阳性信号定位于纤维细胞（Fibrillar cell，F细胞）和吸收细胞（Resorptive cell，R细胞），R细胞中的阳性高于F细胞（图版-1）。卵巢发育Ⅲ期，肝胰腺中的Es-Bco1 mRNA主要存在于F细胞中（图版-4），其余细胞中没有阳性信号。

1-3为蜕壳后期（AB期）肝胰腺组，4-6为卵巢发育Ⅲ期肝胰腺组。其中，原位杂交反义探针结果为1和4；正义探针为对照，杂交结果为2和5；H.E染色结果为3和6。F.纤维细胞；R.吸收细胞。

1-3 were hepatopancreas groups at the post-molting stage （AB）， 4-6 were hepatopancreas groups at the stage Ⅲ of ovarian development. Among them， the results of in situ hybridization antisense probe were 1 and 4， as the control， the hybridization results were 2 and 5. H.E staining results were 3 and 6. F.Fibrillar cell； R.Resorptive cell.

图版　中华绒螯蟹蜕壳后期（AB期）和卵巢发育Ⅲ期肝胰腺中Es-Bco1 mRNA的组织定位

Plate　Localization of Es-Bco1 mRNA in hepatopancreas at post-molting stage （AB） and

ovarian developmental stage of Eriocheir sinensis

2.4 高pH慢性胁迫对中华绒螯蟹肝胰腺Bco1基因表达、色泽及类胡萝卜素含量的影响

为了探讨水体高pH慢性胁迫对河蟹肝胰腺Es-Bco1基因表达、色泽及类胡萝卜素含量的影响，本研究检测了3种常见pH条件下（pH 8.0对照、pH 9.0、pH 10.0），河蟹肝胰腺中该基因的相对表达水平、肝胰腺色泽及类胡萝卜素含量变化情况。结果表明，河蟹在高pH胁迫30 d后，随着pH的提高其肝胰腺中Es-Bco1 mRNA呈现增加趋势（图6a），色泽参数L^*值、a^*值和b^*值均显著下降（P<0.05）。其中，pH 10.0组和pH 9.0组的L^*值和b^*值显著低于pH 8.0组（P<0.05）；pH 10.0组的a^*值显著低于pH 8.0组（P<0.05），见图6b。此外，肝胰腺中总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量随水体中pH升高而呈现显著下降趋势（P<0.05）。其中，pH 10.0组和pH 9.0组的总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量显著低于pH 8.0组（P<0.05），见图6c。

图6 高pH慢性胁迫对中华绒螯蟹肝胰腺中Es-Bco1 mRNA表达水平、色泽及类胡萝卜素含量的影响

Fig.6 Effects of chronic stress of high pH on Es-Bco1 mRNA expression level， color parameter and carotenoid content in hepatopancreas of Eriocheir sinensis

柱状图上方含有不同字母表示差异显著（P<0. 05）。

Different letters above the bar chart indicate significant differences （P<0. 05）.

3 讨论

动物体内类胡萝卜素经类胡萝卜素加氧酶（如BCO1，BCO2和NinaB）分解代谢成一系列重要的生物产物来维持机体正常的生理代谢^［

12-13，16］。基于前期从中华绒螯蟹基因组数据中筛选到EsCCO1 - EsCCO6^{［参考文献 19

百度学术}19］，本研究成功获得了中华绒螯蟹Bco1基因序列，该基因编码的蛋白具有1个RPE65结构域，符合典型的CCO家族结构特征，RPE65结构域在单个供氧分子或两个氧原子的结合下发挥氧化还原酶活性^{［参考文献 34

百度学术}34］，说明Es-Bco1可能起到促进类胡萝卜素代谢的作用。系统进化树结果显示EsBCO1与三疣梭子蟹亲缘性最高且4种甲壳动物聚为一簇，揭示了Bco1基因在甲壳动物进化过程中相对保守，可能具有相似的生物学功能。此外，在中华绒螯蟹和三疣梭子蟹BCO1蛋白序列中缺失LPKVA和KISS序列，而软甲纲物种和线虫纲物种均缺少Motif 10，推测这可能与蟹类进化过程中的片段丢失有关。

哺乳动物BCO1可以裂解类胡萝卜素产生维生素A^［

14］，维生素A缺乏会导致黄斑变性等眼部疾病^{［参考文献 35

百度学术}35］，且果蝇NinaB对其视觉色素产生也起到重要作用^{［参考文献 17

百度学术}17］，本研究发现Es-Bco1在眼柄中高表达，推测Bco1可能在中华绒螯蟹视觉功能上也发挥着重要的作用。此外，在水产动物的相关研究中，Bco基因的下调会导致脊尾白虾肝胰腺和虾夷扇贝闭壳肌颜色变黄，增加其类胡萝卜素的积累^{［参考文献 18

百度学术}18，36］。在本研究中，Es-Bco1还高表达于内膜组织，甲壳动物的内膜和甲壳中类胡萝卜素的积累决定其体色^{［参考文献 37

百度学术}37］，Bco1在中华绒螯蟹体色形成上存在一定作用。肝胰腺作为甲壳动物最主要的营养物质消化吸收和存储器官^{［参考文献 38

百度学术}38］，参与类胡萝卜素等物质的代谢，且肝胰腺颜色与其类胡萝卜素组成和含量相关，推测Bco1在中华绒螯蟹体色形成与肝胰腺类胡萝卜素代谢功能上也发挥着重要的作用。然而，关于Bco1在中华绒螯蟹各组织中的具体功能还有待于进一步研究。

蜕壳与卵巢发育是中华绒螯蟹的重要生物学过程。处于蜕壳AB期的中华绒螯蟹刚完成蜕壳，新的外骨骼还未完全硬化，肝胰腺中高表达的Bco1加快了体内类胡萝卜素的裂解，提供了更多的类胡萝卜素代谢产物来促进身体发育^［

39］。随后，蜕壳C期其新的外骨骼已经完全硬化，不再需要大量的营养物质。此外，类胡萝卜素经BCO1裂解代谢成维生素A，而维生素A的代谢物维甲酸是维甲类X受体（Retinoid X receptor，RXR）的天然配体，甲壳动物RXR可以与蜕皮激素受体形成二聚物，参与蜕壳的调控^{［参考文献 40

百度学术}40］，中华绒螯蟹RXR mRNA在蜕壳AB期的肝胰腺中高表达与Es-Bco1结果吻合^{［参考文献 41

百度学术}41］，进一步揭示了Bco1可能参与中华绒螯蟹蜕壳调控。完成蜕壳的雌体成蟹的卵巢通常开始快速发育，需要摄取大量的营养物质以促进其发育^{［参考文献 42

百度学术}42］。Es-Bco1基因在卵巢发育Ⅲ期肝胰腺组织高表达，可能是因为卵巢发育进入外源性卵黄合成期^{［参考文献 29

百度学术}29］，需要从饲料中摄取更多的类胡萝卜素用于性腺发育，在肝胰腺中类胡萝卜素可以被BCO1酶解后进一步通过其他代谢步骤转化为维生素A^{［参考文献 43

百度学术}43］。此外，本研究还发现在卵巢中Es-Bco1几乎不表达。由此可见，Es-Bco1在河蟹蜕壳和卵巢发育的肝胰腺中起着非常重要的作用。另外，有研究^{［参考文献 44

百度学术}44］表明，R细胞在蜕壳AB期肝胰腺中占主要优势， F细胞是甲壳动物消化酶的主要合成位点。所以Es-Bco1 mRNA在蜕壳AB期和卵巢发育Ⅲ期肝胰腺中的定位差异，可能与细胞的功能及细胞数量变化有关，进一步导致Es-Bco1在蜕壳时期和卵巢发育过程中发挥不同的功能。

高pH胁迫是水产养殖中常见的环境压力，可导致水产动物机体中活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）增加，引起氧化应激，使得体色改变^［

45-46］。甲壳动物的体色与其类胡萝卜素含量和组成密切相关^{［参考文献 47

百度学术}47］，研究^{［参考文献 48

百度学术}48］发现暴露于溴氰菊酯的幼蟹肝胰腺色泽度出现明显的下降，且总类胡萝卜素和β-胡萝卜素含量均显著降低。与本研究结果相似，所以我们推测幼蟹在高pH胁迫下，肝胰腺中的类胡萝卜素被过度消耗导致肝胰腺白化。长时间（30 d）高pH胁迫引起肝胰腺Es-Bco1表达量上升，这一结果与先前的溴氰菊酯胁迫研究趋势相似^{［参考文献 48

百度学术}48］，推测其原因：（1）高pH胁迫导致幼蟹摄食能力下降，使其难以获得足够的类胡萝卜素，经EsBCO1等酶催化转化成的维生素A减少，造成维生素A缺乏。在视黄酸信号通路中，肠特异性转录因子（Intestine specific homeobox，ISX）会抑制Bco1的表达，而维生素A缺乏会降低ISX的表达，导致Bco1表达增加^{［参考文献 49

百度学术}49］；（2）类胡萝卜素作为动物体内强大的抗氧化剂能够清除ROS^{［参考文献 50

百度学术}50］，甲壳动物受到环境胁迫时，ROS水平升高，促进Es-Bco1表达水平上调，同时造成肝胰腺中沉积的类胡萝卜素水平降低^{［参考文献 51

百度学术}51］。总之，中华绒螯蟹Bco1对高pH慢性胁迫有一定的调控作用，且可能参与免疫调控。

4 结论

中华绒螯蟹Es-Bco1基因具有一个典型的RPE65结构域，广泛表达于各组织，其中内膜中、眼柄和肝胰腺中表达量相对较高。中华绒螯蟹蜕壳和卵巢发育过程中，肝胰腺中Es-Bco1 mRNA表达水平分别在蜕壳后期（AB期）和卵巢发育Ⅲ期最高，且主要定位于AB期的F细胞和R细胞，卵巢发育Ⅲ期的F细胞中。高pH胁迫会导致中华绒螯蟹肝胰腺中Es-Bco1基因表达量显著上调，L^*值、b^*值、总类胡萝卜素含量及β-胡萝卜素含量显著下降。有关Es-Bco1在中华绒螯蟹蜕壳周期和卵巢发育过程中的具体生理功能和表达调控机制尚有待深入研究。

利益冲突

作者声明本文无利益冲突

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