摘要
鱼类骨骼肌中富含大量线粒体，尤其在红肌中线粒体含量很高。线粒体对维持鱼类骨骼肌的收缩具有重要作用。Tafazzin（taz）基因作为合成线粒体特异性磷脂心磷脂的重要基因，对线粒体ATP的产生有关键作用。通过对斑马鱼的肌肉组织进行taz基因切片原位杂交，结果显示：taz基因在斑马鱼骨骼肌中大量表达，且特异性表达在肌原纤维的I带中。通过CRISPR/Cas9技术在构建斑马鱼taz缺失突变体ta
关键词
鱼体内骨骼肌是占体质量比例最大的一类组织（可达40%～60%），在运动过程中是体内代谢最活跃组织之
Tafazzin（taz）基因由BIONE等于1996年发现并命名，编码TAZ蛋
斑马鱼AB品系来自中科院上海生命科学研究所，饲养于上海海洋大学水产与生命学院。养殖循环水温度为28.5 ℃。分别于每天8：00和17：00投喂两次，其中幼鱼投喂草履虫，成体鱼投喂卤虫。光照周期为10 h黑暗和14 h光照。实验方案经上海海洋大学动物伦理委员会批准， 并遵守中国科学技术部制定的《实验动物伦理待遇指南》。
根据NCBI网站提供的斑马鱼taz cDNA基因序列设计探针引物，上游引物F：CTGGTCCAAAGGTAACTGTATG；下游引物R：GCTGGACATTCTTCCAGATG。克隆探针序列至pGEM-T载体。大量抽提含目的片段基因的质粒，用限制性内切酶（ThermoFisher Scientific，美国）线性化质粒，用DNA纯化试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］回收线性化的模板质粒，重悬于0.1% DEPC水。用SP6 RNA Polymerase或T7 RNA Polymerase （Promega，美国）合成地高辛（DIG）标记的RNA反义或正义探针，RNA转录反应体系如下：1 μL SP6 或T7 RNA Polymerase，0.5 μL RNase Inhibitor（40 U），2 μL 10×DIG Mix， 2 μL DTT（100 mmol/L），4 μL 5×Transcription buffer，线性化质粒DNA 1 μg，RNase free水补足至20 μL，37 ℃ PCR仪孵育2 h，电泳检测转录效果，若转录成功加1 μL RNase-free DNAase，37 ℃ PCR仪孵育15 min消除DNA模板。然后加入2.2 μL RNase-free LiCl（5 mol/L）和40 μL的无水乙醇（冰预冷），-20 ℃下静置至少4 h沉淀RNA。然后4 ℃ 13 000 r/min离心30 min，去上清，用75%乙醇漂洗，4 ℃ 13 000 r/min离心15 min，去上清，在无菌操作台吹干10 min，最后向RNA沉淀中加30 μL DEPC水溶解，取1 μL进行电泳检测其完整性，并用NanoDrop 2 000测定RNA浓度，保存于-80 ℃备用。
取1月龄斑马鱼（此时肌肉组织发育基本完全），经麻醉剂处理后用4%多聚甲醛（4% PFA）溶液在室温条件下固定24 h。在显微镜下剪去鳍条组织、去除皮肤鳞片后，将样本于PBS中清洗3次，每次10 min。组织经梯度脱水后，二甲苯处理样本至透明并于65 ℃浸蜡包埋。用Leica轮转式切片机进行连续切片，切片厚度7 μm。
将制备好的切片经二甲苯脱蜡，并梯度复水。使用PBST孵育数次，向组织上滴加20 μL的10 μg/mL蛋白酶K，37 ℃消化3 min，暴露目的核苷酸。经甘氨酸处理后，使用PBST漂洗数次后，入5×SSC中平衡15 min，55 ℃预杂交3.5 h。向每张玻片滴加40 μL探针浓度为5 ng/μL的杂交液，置于含少量2×SSC的湿盒中放置于黑暗环境65 ℃过夜（10~12 h）。使用65 ℃的2×SSCT和0.1×SSCT漂洗组织各两次，取出玻片冷却片刻，用少量室温PBST冲洗玻片数次。1%封闭液室温孵育1 h，滴加40 μL用封闭液稀释5 000倍的抗地高辛抗体-AP结合物，室温湿盒孵育2 h，使用适量PBS冲洗后，漂洗数次，AP Buffer浸洗30 min，向玻片上滴加40 μL BCIP-NBT显色液在黑暗条件下显色1~12 h，定时镜检以防显色过度。显色结束后，适量PBST漂洗后，浸洗10 min，再入蒸馏水中浸洗数次，将切片梯度脱水、封片并拍照。
在UCSC数据库上查询斑马鱼taz基因的基因组DNA序列（GeneID： 30526）。根据CRISPR/Cas9基因编辑靶点设计网站（http：//genome-asia.ucsc.edu/）选择基因敲除的靶点。利用HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit （NEB，cat#E2050）进行体外转录，并用RNA Clean & Concentrator Kit（Zymo Research，cat#R1017）纯化获得sgRNA。将sgRNA（50 pg） 和Cas9 蛋白（Genescript， cat#Z03389-50）混合后用于注射，Cas9蛋白的工作浓度为1 μg/μL，每个胚胎注射量约为1.4 nL。将注射后经检测有效编辑的F0斑马鱼饲养至成年，并进行突变体纯合品系构建。
对48 hpf斑马鱼的胚胎进行整体荧光染色。胚胎经过0.6 mmol/L麻醉剂（药品名：Ethyl 3-Aminobenzoate methanesulfonata， cat#886862， 麦克林公司）麻醉后，于4% PFA中4 ℃固定过夜。用含0.1% Tween-20的PBST清洗胚胎3次每次10 min。通过冰丙酮处理8 min，以增加细胞膜通透性。PBST清洗30 min后，用phallodin-TRITC［cat#40734ES75，翌圣生物科技（上海）股份有限公司］进行肌动蛋白染色20 min。PBST清洗30 min后，用抗荧光淬灭封片剂［cat#E675011-0010，生工生物工程（上海）股份有限公司］封片。样品经Leica SP8激光扫描共聚焦拍照分析。
利用茜素红染色对3月龄斑马鱼进行整体骨骼染色。斑马鱼经过麻醉剂麻醉后，用4% PFA固定至少24 h。然后，用PBS清洗鱼体30 min，去除多聚甲醛溶液。接着用含1% Tween20的TBST浸泡样品30 min，脱去鱼体表皮脂肪；然后浸泡在V（3% H2O2）∶V（1% KOH）=1∶9溶液中，于强光照下脱去鱼体表皮色素；经1%胰蛋白酶消化至鱼体透明后，用含1%茜素红的1% KOH溶液进行硬骨染色，最后经过甘油梯度进行观察。茜素红染色后的鱼体用于单根肌间骨的分离实验。于解剖镜下进行鱼体解剖，从尾部开始取出肌肉组织中的肌间骨，去除多余肌肉组织后，排列在盖玻片上，最后用50%甘油进行封片。
对受精后30 d（30 dpf）的斑马鱼躯干进行切片原位杂交，观察taz基因在胚后发育的表达情况。结果显示，在斑马鱼躯干组织，taz基因的mRNA探针在肌原纤维、部分骨组织如鳍条骨、肌隔中均有表达，尤其在肌肉组织中高表达。为了进一步了解taz基因在肌肉组织中的表达，对肌肉组织切片进行局部放大，观察taz基因在肌原纤维中的表达情况（
图版Ⅰ 斑马鱼大侧肌及尾鳍组织taz基因的原位杂交Plate Ⅰ In situ hybridization for taz in skeletal muscle and caudal fin tissue
（a） 尾鳍组织及肌肉组织taz基因探针原位杂交的实验组及反义探针组，n=3； （b） 尾鳍组织及肌肉组织taz基因原位杂交的正义探针杂交图， n=3。
（a） In situ hybridization of caudal fin and skeletal muscle tissue with anti-sense probe； （b） The hybridization with the sense probe of taz； Sample size for experimental group and control are 3.
在斑马鱼中，taz基因共有4个外显子，为成功破坏taz的基因功能，在第一外显子区选择靶点，设计20 bp的靶点序列（
图1 CRISPR/Cas9构建的taz基因突变类型
Fig.1 taz mutant type constructed by CRISPR/Cas9
（a） taz基因结构及基因敲除靶位点，E1-E4分别为taz基因的4个外显子，ATG为起始密码子，红色下划线区域为基因敲除靶点序列；（b） taz突变体的核苷酸序列及taz突变后编码的氨基酸序列；M为启始甲硫氨酸；绿色碱基为基因敲除后靶点区发生变化的碱基，红色下划线部分的氨基酸为无义突变后提前终止编码的氨基酸。
（a） taz gene structure and gene knockout target site， E1-E4 are the 4 exons of taz gene respectively， ATG is the start codon， the red underlined area is the gene knockout target sequence； （b） The nucleotide sequence of ta
对野生型和ta
图2 taz突变体和野生斑马鱼的生长曲线
Fig.2 Growth curve of taz mutant and WT zebrafish
*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图版Ⅱ 发育不同时期ta
（a） 野生型斑马鱼发育不同时期的整体图， n=20；（b） ta
（a） The whole observations of wild-type zebrafish at different stages of development，n=20；（b）The whole observation of ta
利用肌动蛋白抗体（鬼笔环肽）对野生型和ta
图3 ta
Fig.3 F-actin staining analysis of muscle fibers in ta
（a） 斑马鱼整体荧光染色，红色为被鬼笔环肽标记的肌动蛋白；（b） 肌动蛋白宽度统计，n=10；***P<0.001。
（a） Whole immunofluorescence stain for actin，the red color marked the actin stained by phalloidin； （b） Statistical analysis for the width of actin， n=10； ***P<0.001.
对3月龄的ta
图4 ta
Fig.4 Whole Alizarin stain and single intermuscular bone sequence in ta
（a） 斑马鱼整体骨骼染色示意图，黑色箭头指示分别为髓弓小骨和脉弓小骨；黑色实线代表指示整个肌间骨的长度；（b） 体外分离的ta
（a） The whole bone stain of ta
骨骼肌富含线粒体，线粒体是骨骼肌功能的决定性因素之一。线粒体代谢生成ATP为肌纤维收缩提供能量，这对于骨骼肌的功能维持至关重要。为明确taz基因在斑马鱼骨骼肌发育中的作用，通过切片原位杂交，发现taz基因在斑马鱼骨骼肌纤维中有大量表达，且骨骼肌纤维中的taz基因主要表达于肌小节中I带（明带）位置。线粒体位于骨骼肌纤维的I带，负责提供肌肉收缩过程中肌动蛋白丝滑动所需要的AT
Taz调控一种线粒体酶：酰基转移酶的合成，是合成成熟形式的心磷脂所必需
通过在斑马鱼中构建ta
综上，本研究通过切片原位杂交分析了taz基因在斑马鱼躯干大侧肌组织的表达位置。原位杂交显示taz基因在斑马鱼的肌肉组织中的表达呈现组织特异性，主要表达在肌原纤维的I带。通过构建taz缺失突变体，发现taz基因突变后在斑马鱼中会引起Barth综合征表型，且会影响肌动蛋白的收缩。研究结果将为进一步了解taz基因在鱼类中的功能提供理论依据。
利益冲突
作者声明本文无利益冲突
参考文献
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